BMY牛MSTN基因exon 2克隆及序列分析

和占星，亐开兴，2，张继才，王安奎，金显栋，杨国荣，昝林森，黄必志＊

（1.云南省草地动物科学研究院，云南 昆明 650212；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；3.国家肉牛改良中心，陕西 杨凌 712100）

BMY牛较为广泛地适应于我省湿热地区，与云南黄牛及其他杂交组合能获得较好的杂种优势［1］，BMY牛以其自身的优良特性而备受云南省地州肉牛养殖户的青睐。检测BMY牛的肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因多态性，通过候选基因研究肌肉细胞分化和发育的重要功能基因的分子生物学机制［2－5］，探索抑制肌生成抑制素活性而增加肌肉量的方法，在农业和医疗方面有潜在的应用价值，肌生成抑制素研究的突破将对猪、肉鸡、肉牛等畜禽生产性能的提高具有重要意义［3，6，7］。寻找畜禽重要经济性状的连锁标记，候选基因法是非常有效的，它可以更直接地研究基因的多态性与经济性状的关系［3，6，7］。

另外，MSTN在肌肉的生长发育中起着极其重要的作用，牛的MSTN基因是影响肉用性状的重要候选基因之一。通过探索BMY牛的单核苷酸多态性位点为以后BMY牛的肉用性状研究提供一定的分子基础，同时也希望能够对婆罗门牛、云南黄牛及大额牛等开展更多的分子生物学工作和标记辅助选择相关研究起到抛砖引玉的初衷。

1 材料与方法

1.1 PCR扩增

实验材料为BMY牛（R5263）总DNA。根据GenBank中牛的 MSTN全序列（登录号：AB076403）［7］设计exon 2 引物，Forward：5′－GTTCATAGATTGATATGGAGGTGTTCG－3′ 和Reverse：5′－ATAAGCACAGG AAACTGGTAG TTATT－3′。PCR反应体系为：按50μL准备，含10×Buffer 5μL，25mmol／L MgCl21.5μL，2.5 mmol／L dNTP 2μL，10pmol／μL上、下游引物各1 μL，5U／μL Taq酶0.3μL，DNA模板20～50ng，以灭菌水补足剩余体积。然后以25μL／管反应体系进行PCR扩增，PCR反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性1min，52℃退火40s，72℃延伸1 min，共36个循环；72℃后延伸10min；4℃保存。产物经1.5%琼脂糖凝胶检测，2%琼脂糖凝胶回收，PCR产物回收时做割胶回收（按上海华舜生物技术有限公司回收试剂盒说明书操作）。

1.2 克隆测序

1.2.1 将回收的PCR产物检测 加样量跟DL 2 000Marker相比，目的产物～400bp，与 Marker亮度相同的加3μL回收产物，比Marker亮的加2.5 μL。

1.2.2 连接 溶液Ⅰ加2.5μL，载体0.5μL，模板量按步骤1加，吸打混匀，瞬时离心，16℃连接过夜。

1.2.3 取感受态细胞置于冰上溶解 取50μL的感受态细胞直接加入到连接产物中，用移液器慢慢吸打混匀，然后置冰上30min。准备工作：①把水浴锅调至42℃；②准备复苏培养基；③开启摇床电源，调节温度至37℃。

1.2.4 调节恒温培养箱至37℃ 再把加入了感受态细胞的连接产物放42℃水浴90s，立即置冰上5 min。然后再全部转移至复苏培养基中，在摇床上以200r／min 37℃培养1～2h。

1.2.5 涂板 每管取150～200μL加到事先准备好的平板上，用1.5mL EP管涂匀，放置37℃30 min，之后把培养平板倒置培养11～13h。

1.2.6 按菌落PCR法进行扩增 检测，经琼脂糖凝胶回收后测序。

1.3 数据分析

序列核对经DNAStar 6.0软件进行人工校对，同源性比较经DNAman 5.2.9比对，N－J树（Neighbor－Joining tree，N－J tree）由 MEGA 4.1软件构建。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物的检测和测序

经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，所得片段约400 bp，与预期片段大小相吻合。基于Ensembl（http：／／www.ensembl.org／index.html）参考了普通牛（Bos taurus）、瘤牛（Bos indicus）等哺乳动物的MSTN基因exon 2，界定了BMY牛与大额牛的MSTN 基因exon 2为372bp。BMY 牛（R5263）MSTN 基因exon 2序列（1－372）：

BMY牛MSTN基因exon 2的碱基组成A、T、G、C分别为33.0%、24.2%、21.8%和21.0%，大额牛079－gayal的分别为 33.3%、24.2%、21.5% 和21.0%，差异不大。牛亚科物种中，MSTN基因exon 2很保守（图1），第39、46、84及266位存在多态性，前三个位点均为同义突变，第266位为错义突变，造成了日本和牛（Japanese Black cattle，JBC）第89位氨基酸由 Asn（N）变为Ser（S）（图2）。

2.2 BMY牛MSTN基因exon 2编码的核苷酸同源性比较

经过DNAman 5.2.9软件比较几个物种的核苷酸同源性（表1），牛亚科物种之间的同源性在98.7%～100.0%之间；牛亚科物种与其他哺乳动物的同源性稍低，与人猿超科的同源性在94.1%～95.4%之间，与小鼠和狗的同源性更低，与家鸡的同源性仅在85.5%～85.8%。

图1 12个物种MSTN基因exon 2的核苷酸变异

表1 12个物种MSTN基因exon 2的核苷酸序列同源性比较

2.3 几个物种MSTN基因exon 2编码的氨基酸变异

经过 MEGA 4.1软件ClusterW比对，翻译得到对应的124个氨基酸残基见图2。由图2可看出，BMY牛、瘤牛、牦牛与大额牛079－gayal的氨基酸序列一致，与日本和牛不同的是第89位氨基酸发生了天冬酰胺（Asn）→Ser丝氨酸（Ser）的突变。同时，还可看出人猿超科物种的特异性，如第39位的谷氨酸（Glu）；而家鸡的序列变异与哺乳动物之间差异很大。

2.4 基于牛MSTN基因exon 2的系统发育关系

通过Mega 4.1构建了以家鸡为外群的几种哺乳动物之间的N－J系统发生树（图3），可见11种哺乳动物与家鸡明显分开，牛亚科物种中的牦牛、大额牛、日本和牛、瘤牛与BMY牛聚为一支，而人与黑猩猩、猕猴聚为一支，两支的支持率较高（99%）。

从图2还可看出，具有明显大额牛体型特征的个体079－gayal（Bos frontalis）与瘤牛（zebu，Bos indicus）关系更近，推测大额牛在其形成历史中曾经受过家养牛的基因渐渗现象［8－10］。BMY牛培育中含有50%婆罗门牛血统，与包括日本和牛的牛亚科物种聚为一支，由于相互关系较近，这一支的支持率较低（不到50%），但与水牛的关系非常明朗，关系较远。

图2 12个物种MSTN基因exon 2的氨基酸变异

3 讨论

经过了近30年的选育，BMY牛已形成了遗传性能稳定的新品种（系），适宜于我国南方热带亚热带地区，抗蜱性强，具有抗血液原虫病的能力。BMY牛初生重公犊31kg，母犊29kg，36月龄体重公牛620kg以上，母牛400kg以上。母牛初情期8～10月龄，初配年龄12月龄或体重在250kg以上，发情周期为21d（17～23d），发情持续时间为12～27h，妊娠期为282d。在常规饲养条件下，BMY牛的泌乳期为245～305d，产乳量为752.2±133.2 kg。公牛18月龄或体重在300kg以上可配种或采精［11］。在维持饲养标准170%的条件下，12～24月龄日增重公牛1.1kg、母牛0.9kg，24月龄屠宰率公牛63%、母牛59%，净肉率公牛54%、母牛51%，眼肌面积公牛85cm2、母牛70cm2。肉质细嫩、多汁，大理石纹明显。公牛的BPI为5.4±0.5，母牛为4.0±0.3［12］。鉴于 BMY 牛的产肉性能及肉质特性，选择与产肉性状相关的分子标记进行辅助选择，无疑具有重要的理论意义。

BMY牛MSTN基因exon 2与牛亚科物种的同源性很高，在98.7%～100.0%之间，与其他哺乳动物的同源性稍低（92.7%～95.4%），与家鸡的同源性不到90.0%。同时由N－J分子进化树可看出，BMY牛、大额牛与瘤牛的关系最近，表明二者受瘤牛的影响较大，且BMY牛垂皮较发达，公牛具有明显的肩峰；同时与日本和牛、牦牛的关系也较近，与水牛的关系远。与其他哺乳动物的关系明显分化，与其他核基因如乳蛋白基因、溶菌酶基因等所构建的系统发生树所揭示的结论相一致［7，13，14］。

图3 基于MSTNexon 2构建的12个物种的N－J系统发生树

本研究为BMY牛的分子标记奠定了一些基础性工作，至于MSTN基因与BMY牛经济性状的关联分析还有待进一步研究，同时增加大额牛的样本量检测，从多个角度全面地揭示其遗传组成。

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