苏云金芽胞杆菌晶体毒素的多样性

赵新民， 刘淑云， 周攀登， 徐 玲， 夏 莉， 夏立秋， 成飞雪

（1.湖南城市学院化学与环境工程系，益阳 413000；2.湖南师范大学生命科学学院微生物分子生物学湖南省重点实验室，长沙 410081；3.湖南省植物保护研究所，长沙 410125）

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis Berliner，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，在昆虫尸体、土壤、水体、沙砾和落叶等多种生态环境下生存。据估计全世界分离保存的Bt菌株已有6万多个。按Bt菌株营

养细胞鞭毛的免疫反应将其划分为不同的血清型。目前已发现71个血清型、84个亚型［1］。

苏云金芽胞杆菌的杀虫活性范围包括无脊椎动物节肢动物门中的鳞翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）、直翅目（Orthoptera）等9个目的昆虫，同时还发现对线形动物门（Nemathelminthes）、原生动物门（Protozoa）中某些有害种类有杀虫活性［2］。Bt制剂已发展成为目前世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂。

Bt的杀虫活性主要来自于菌体内在形成芽胞期间生成的伴胞晶体。Bt在营养体生长到稳定期的后期，在其一端或中央开始形成一个卵圆形的芽胞，生长至衰亡期后芽胞囊破裂，芽胞被释放出来。形成芽胞的过程中，在菌体内的一端或两端形成一个或多个形状一致或不同的伴胞晶体［3］。伴胞晶体是Bt的主要毒力因子，其含量可以占到芽胞形成过程中菌体产生蛋白总量的20%～30%［4］。伴胞晶体主要为δ内毒素的杀虫晶体蛋白，又称为晶体毒素或简称为毒素，毒素被敏感昆虫的幼虫吞食后，在幼虫肠道碱性环境和蛋白酶的作用下释放出活性毒素，活性毒素与幼虫中肠上皮细胞的特异受体发生结合并形成孔道，破坏细胞渗透压平衡，最终导致昆虫死亡［4］。

1995年Crickmore等在无脊椎动物病理学年会上首次提出、并于1998年发表了Bt毒素新的命名原则［5］，即只根据毒素蛋白氨基酸序列的同源性确定其不同的分类等级，而与其生物活性无关，从而形成了一个趋向完善的、开放式分类系统。这个系统利用计算机比较毒素氨基酸序列的同源性，以45%、78%和95%为界，将毒素划分为4个分类等级，依次用阿拉伯数字、大写英文字母、小写英文字母和阿拉伯数字表示。氨基酸同源性在45%以下的，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在45%～78%之间的，为第二等级，用大写英文字母表示；同源性在78%～95%之间的，为第三等级，用小写英文字母表示；这一级又称为模式毒素（holotype toxin）。同源性在95%以上的，为第四等级，用阿拉伯数字表示。该系统实际上是一个开放系统，新发现的Bt毒素与已知毒素序列比对，就可以提交这一分类系统命名。截止到2012年3月1日，已有240种模式毒素被国际Btδ内毒素命名委员会收录［6］。

目前习惯上根据伴胞晶体蛋白氨基酸序列和毒理机制简单地分为Cry（crystal）毒素（即通常意义上的晶体蛋白）和Cyt（cytolytic）毒素两大家族。实际上前者在氨基酸序列、三维结构、靶标生物和杀虫机理还有很大的不同，还可以继续划分为多个毒素类别［7］。由此可将所有已知序列的伴胞晶体蛋白分为3－结构域毒素类、Cyt毒素类、类Mtx1毒素类、二元毒素类、Cry6类、Cry22类和伴胞素（parasporin）类。这种整合分类对于我们从整体上认识Bt毒素的多样性具有重要意义。

1 各类毒素的结构特点和生物学功能

表1将全部收录的模式毒素分成Cry毒素和Cyt毒素前后两部分，并将Cry毒素中的类Mtx1毒素类、二元毒素类、Cry6类、Cry22类和伴胞素类在表1中的位置分别用黄色、绿色、紫红色、蓝色和灰色标出，其中Cry46Aa和Cry46Ab可以分属于两个类别。值得注意的是表中有多种毒素并非全部来自Bt，如 Cry16Aa、Cry18Ca、Cry43Ba、Cry49Ab 和Cry70Bb等。其中Cry16Aa来自双酶梭状芽胞杆菌菌株（Clostridium bifermentans subsp.malaysia）；Cry49Ab来自球形赖氨酸芽胞杆菌 （Lysinibacillus sphaericus）。Btδ内毒素命名委员会收录标准是Bt中具有杀虫活性的伴胞晶体毒素或与之存在较高序列同源性的其他来源毒素［6］。为了讨论方便，这里仍将所有模式毒素放在一起。

1.1 3－结构域毒素

在所有已知的Bt晶体毒素中，大多数为3－结构域毒素。3－结构域毒素是目前研究最多Bt毒素，其杀虫谱较广。比较毒素的氨基酸序列，可知这些毒素的毒性片段在一级结构上都含有5个保守区。大部分Bt毒素由N－端活性区部分和C－端非活性区部分组成，如 Cry1、Cry4、Cry5、Cry14和 Cry21毒素，分子量大小在120～140ku之间；在被蛋白酶水解激活的过程中，C端有近一半的氨基酸残基被切除，形成大约60ku的毒性区片段。另外一部分蛋白如Cry2、Cry3、Cry10、Cry19和Cry20毒素只有N－端活性区部分，分子量约为60～75ku，没有典型的C端延伸的尾巴，被认为是“自然切除”过的蛋白［8］。

已经解析了下列几种Bt毒素的三维结构：Cry3Aa［9］、Cry1Aa［10］、Cry2Aa［11］、Cry3Bb1［12］、Cry4Ba［13］、Cry4Aa［14］和 Cry8Ea［15］。对其中几种毒素的结构进行比较［16］，尽管它们的一级结构有较大差异，但它们的三维结构很相似，都是由3个典型的结构域组成。由此推断，大多数含有5个保守区并有一定的氨基酸序列同源性的毒素都具有3个结构域，它们可能就有相似的毒理机制。结构域Ⅰ主要参与昆虫中肠上皮细胞细胞膜孔道的形成；结构域Ⅱ参与毒素与受体蛋白的结合并由此决定毒素的杀虫谱；结构域Ⅲ的功能尚不明确，可能具有多种功能［17］。最近我们研究了Cry1Ac毒素结构域Ⅲ中的色氨酸 W544［18］和天冬酰胺 N546［19］的作用。将W544替换成苯丙氨酸（F），在不影响其活性的前提下，大大降低了Cry1Ac毒素对紫外线的敏感性，同时还在一定程度上增强了其对蛋白酶的稳定性，而N546涉及与受体的结合并影响毒素的毒力。

1.2 Cyt毒素

Cyt毒素或称溶细胞毒素，是Bt伴胞晶体中有别于其他杀虫晶体蛋白一类毒素。它主要对双翅目昆虫有毒杀作用，体外试验表明Cyt毒素对多种细胞具有毒性［20］。目前已发现9种Cyt模式毒素。到目前为止蚊虫还没有对Bt以色列亚种产生抗性，其原因可能是该Bt菌株伴胞中存在CytlA［21］。Cyt2Aa和 Cyt2Ba的三维结构已经解析［22－23］，结构特点是：Cyt毒素没有典型的3－结构域特征，只包含一个结构域，二个外层α－螺旋发夹结构缠绕一个混合的β折叠。

CytlA由于其特殊性常用来增强杀蚊协同性和延缓蚊虫对杀蚊毒素的抗性，还用来扩宽杀虫谱，原因是CytlA与其他毒素在氨基酸序列和毒理作用方面完全不同，它对一些脊椎动物和无脊椎动物细胞有很高的溶解性，对细胞膜脂质部分的非饱和脂肪具有很高的亲和力，有人认为它的作用模式是去污剂作用模式［24］（detergent－like mode），即通过结合特异的脂肪酸，搅乱膜结构。也有人认为它可能以形成孔的形式发挥作用。

1.3 类Mtx毒素

Mtx毒素是球形芽胞杆菌（Bacillus sphaericus，Bs）在营养期产生的一类毒素，主要分为Mtx1、Mtx2和Mtx3毒素。Mtx2和Mtx3同产气夹膜羧菌（Clostridium perfrigens）的33ku的ε－毒素及绿脓杆菌［Pseudomonas aeruginosa（Schroeter）Migula］的32ku细胞毒素有同源性［25］。

Bt伴胞晶体也存在类似Bs的Mtx毒素，这组毒素还包括Cry23／Cry37、Cry15A／40ku、Cry33A／NT32、Cry53、Cry36、Cry46、Cry51。Cry23A 对某些鞘翅目昆虫具有毒性，通常只有在与较小的Cry37结合在一起才表现出杀虫活性。Cry23／Cry37复合物的结构已经解析，但其原子坐标未公开。Cry23呈长条形，主要由反向平行的β－折叠组成，并与气单胞菌溶素（proaerolysin）非常相似，气单胞菌溶素属于成孔毒素（β－pore－forming toxin），细菌成孔毒素通过分泌，直接侵袭细胞膜并在细胞膜上形成孔结构，导致在正常情况下不能进入细胞内的离子和其他毒性细胞因子进入细胞内、引起细胞膨胀和细胞溶解［26］。因此推测Cry23／Cry37的毒理机制类似于成孔毒素。

Cry15A与一种与之没有关联的40ku蛋白结晶在一起。40ku蛋白本身没有活性，但可影响Cry15A对烟草天蛾［Manduca sexta（Linnaeus）］的活性［27］。40ku蛋白基因与cry15A 基因存在于同一操纵子内。由于体外难以得到有活性的共结晶，有关的作用机制研究受到限制［28］。编码Cry33A／NT32的基因也在同一操纵子内［6］。总之，这组毒素氨基酸序列相互之间差异较大，但都有一个保守基元即被两个富含Ser／Thr侧翼序列包围的两亲环状结构，预示它与插入细胞膜有关［28］（表2）。

表2 类Mtx毒素来源、结构和毒理机制Table 2 Origins，structures and mechanisms of Mtx－like toxins

1.4 二元毒素组

二元毒素通常指是Bs在芽胞形成过程中产生并通过两蛋白的相互作用折叠成位于芽胞外膜内的伴胞晶体，由 BinA （41.9×103）和 BinB （51.4×103）组成。单独的BinA蛋白对蚊虫的毒力低，而单独的BinB对蚊虫无毒，只有两蛋白同时存在时，才表现出最强的杀蚊活性［29］。

Bt伴胞晶体也存在类似的二元毒素，它们与Bs二元毒素有同源性，它们单独存在时没有毒性或毒性很低。这组又可以分为3类，分别为Cry36Aa（ET69）、Cry34／35和Cry48／49。

Cry36Aa（ET69）与Bs的二元毒素有较大的序列相似性，它可以单独发挥毒力，所以并不算真正的二元毒素，该毒素对西方玉米根虫有较弱的毒性［30］。

Cry34／35 包 括 从 Cry34Aa1／Cry35Aa1 到Cry34Ba3／Cry35Ba3共11对二元毒素。编码二元毒素的基因同位于一个操纵子内部，分子量较小的Cry34毒素本身几乎没有毒性，较大的Cry35毒素对西方玉米根虫有一定的毒力。两种毒性同时存在时才能表现出完全的毒力［31］，Cry35Ab1部分片段与蓖麻毒素（ricin）部分片段有同源性。其毒理机制可能是在细胞膜形成孔洞。

Cry48／49 包 括 从 Cry48Aa1／Cry49Aa1 到Cry49Ab2／Cry49Aa4共5对二元毒素。它们实际上来源于Bs，严格来说不属于Bt毒素。它们具有杀蚊活性并与Bt毒素有较高的同源性，如Cry48毒素与Bt具有杀蚊活性的Cry4Aa有33%的同源性，所以他们可能具有Bt毒素的3－结构域特征［32］，并将它们收录在国际Btδ内毒素命名委员会的毒素系统中。

1.5 Cry6

目前有Cry6Aa和Cry6Ba两个模式毒素，它们对线虫具有毒杀活性。虽然已经发现Bt有多种毒素对线虫具有毒杀活性，但Cry6毒素组与其他Bt毒素包括其他具有毒杀线虫的毒素没有序列同源性，没有常见的5个保守序列区，但与许多其他Bt毒素一样，Cry6A也含有一个小的活性核心［8］。Cry6Aa与其他Bt毒素同源性很小。研究发现，含Cry6A基因的转基因番茄植株对根结线虫具有更强的抵抗力，证实Bt毒素可以使植株对内部寄生线虫具有抵抗力，并被认为具有控制转基因植株内植物寄生线虫的潜力［33］。由于Cry6的三维结构尚不清楚，目前对其毒杀线虫的机制有待进一步研究。Marroguin等推测Cry5B毒素作用线虫的机制可能与其作用于昆虫的方式相似［32］，线虫吞入的毒素与线虫肠道内膜结合引起肠内膜渗透性增大，从而破坏了线虫肠道组织使线虫致死。但Cry5B属于3－结构域毒素［35］，Cry6A和Cry5B两种毒素对线虫的作用方式存在着明显的差异［36］。

1.6 Cry22

这一组毒素最先从对膜翅目具有毒杀作用的Bt菌株中分离得到，Cry22有3种模式毒素分别为Cry22Aa、Cry22Ab和Cry22Ba。Cry22Aa1对玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera virgifera）有毒杀活性，Cry22Aa1和Cry22Aa2已经申请专利保护［37］。这一组毒素在序列上与其他毒素的同源性较小。X衍射晶体解析表明，Cry22Aa1为一个长条形6结构域蛋白，包括4个类钙黏蛋白重复序列结构域和一个类似于3－结构域毒素结构域Ⅲ的C－端。但相关的资料未完全公开，其毒理机制未见报道。

1.7 抗癌伴胞素（parasporin）

Mizuki等于2000年通过对A1190Bt菌株的无杀虫活性的毒素的研究［38］，首次发现该毒素存在抗癌活性并将其归入Cry31Aa。抗癌伴胞素模式毒素包 括 Cry31Ab、Cry31Ac、Cry41Aa、Cry41Ab、Cry45Aa、Cry46Aa和Cry46Ab。目前已经成立了一个专门的抗癌伴胞素分类和命名委员会［39］。

Cry31Aal共有723个氨基酸残基，分子量约为81ku，由长度为2 169bp的基因编码。该蛋白存在3－结构域特征及5个氨基酸保守位点，当使用蛋白酶水解其N端后，产生了分子量分别为15、56ku的异二聚体蛋白，由此激活其抗癌活性。

Cry41Aa1和Cry31Aa1序列类似，存在较为典型的3个结构域且有5个保守序列。PS3Aa1共有825个氨基酸残基，分子量约为94ku，同源性较其他Cry蛋白低，但其C端和血细胞凝集素HA－33的C端存在同源性，当其N端和C端同时被酶切后方能呈现出其抗癌活性［40］。

Cry45Aa1由275个氨基酸残基构成，没有其他Bt伴胞晶体毒素常见的5个保守位点，且与Cry15Aa有21%的同源性［41］。

Cry46Aal多肽链由338个氨基酸残基组成。与PS1Aa1不同的是，尽管与其他Cry蛋白相比其序列同源性较低，但与Cry15Aal的同源性较高，而后者又与Bs的Mtx2和Mtx3具有较高的同源性。所以也可以把Cry46Aal放在类Mtx毒素组，由于Mtx毒素与产生的气单胞菌溶素存在同源性，而后者的毒理机制是在细胞膜产生穿孔。所以推测Cry46Aal的毒理机制与成孔蛋白相似。与Cry31Aal类似，Cry46Aal也需要经过酶切才能显示出其抗癌活性，但与前者不同的是，后者需在N端和C端同时酶切才能得到相应具有抗癌活性的片段［42］。

2 评论和展望

Bt是一种在自然界广泛分布的革兰氏阳性细菌，能够在多种生态环境下生存，并在分类学表现出多种血清型和亚型［1］。伴胞晶体的结晶形态有多种，包括菱形晶体、方形晶体和双金字塔等多种形态［3］。晶体的有无及大小形状与毒力密切相关。更重要的是，虽然大部分伴胞晶体毒素的结构有3－结构域特征，但总体而言，伴胞晶体毒素从氨基酸残基序列、杀虫谱及三维结构特征上表现出高度的广泛性，说明伴胞晶体毒素的结构和功能既具有很好的稳定性，同时又具有一定的进化性。由此也说明对伴胞晶体毒素的分类具有非常重要的意义。

将全部毒素分为Cry毒素和Cyt毒素两大家族，这种划分具有笼统性，基本上没有考虑毒素的结构及其作用的靶标生物。后来有人根据靶标生物的特异性，将Bt Cry毒素分为6个大类（主要为系统命名中第一等级）［7］。这种划分仍有局限性，弊端就在于有些毒素对两三个目的害虫具有毒杀活性。事实上毒素的毒力具有广泛性。如已发现有些毒素具有抗癌活性［39］，有些毒素对膜翅目（Hymenoptera）、半翅目（Hemiptera）、蚤目（Siphonoptera）和扁形动物门棘口吸虫目（Echinostomida）具有活性［2］。毒素的多样性和进化性为我们发掘更多的毒素基因和发现毒素新的作用靶标生物打下了基础。

国内已发现超过280种晶体毒素基因，并提交在国际Btδ内毒素命名委员会收录［43－45］。随着新的毒素基因不断被克隆和发现，人们发现有些毒素序列相似，但其杀虫活性不同，而某些毒素具有相同的杀虫活性，其序列同源性却又相差很大，所以以序列同源性和生物活性划分类别的分类系统很难高度统一。目前普遍支持Crickmore提出的开放命名系统［5］，它为更多已知序列但其作用靶标生物未知的毒素找到了分类位置。但在这一分类系统的基础上，根据毒素氨基酸序列、三维结构、靶标生物和杀虫机理进一步分类是很有必要的，这对我们认识Bt毒素的多样性和从分子水平上了解毒素作用模式具有十分重要的意义。

毒素从自然中来，与靶标生物之间的相互作用在进化过程已达到一个相当复杂的水平［46］。晶体毒素是一种致病毒力因子，靶标生物由此产生内部免疫机制。Bt作为一种昆虫的病原物生物，其晶体毒素的毒力发挥需要多种因素的协同作用。随着更多毒素及其作用受体的发现，晶体毒素与受体的互作机制必然呈现高度的复杂性，这又对我们进一步了解毒素的杀虫机制提出了新的挑战。

［1］ 苏旭东，张杰，檀建新，等.苏云金芽孢杆菌及其δ－内毒素基因的分类与鉴定［J］.植物保护，2006，32（2）：15－19.

［2］ Frankenhuyzen K V.Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2009，101（1）：1－16.

［3］ 喻子牛，孙明，刘子铎，等.苏云金芽孢杆菌的分类及生物活性蛋白基因［J］.中国生物防治，1996，12（2）：85－89.

［4］ Ibrahim M A，Griko N，Junker M，et al.Bacillus thuringiensis：agenomics and proteomics perspective［J］.Bioengineered Bugs，2010，1（1）：31－50.

［5］ Crickmore N，Zeigler D R，Feitelson J，et al.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998，62（3）：807－813.

［6］ Crickmore N，Zeigler D R，Schnepf E，et al.Bacillus thuringiensis toxin nomenclature［EB／OL］.（2011－9－18）［2002－06－12］.http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk／Home／Neil＿Crickmore／Bt／.

［7］ de Maagd R，Bravo A，Berry C，et al.Structure，diversity and evolution of protein toxins from spore－forming entomopathogenic bacteria［J］.Annual Review of Genetics，2003，37：409－433.

［8］ de Maagd R A，Bravo A，Crickmore N. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world［J］.Trends Genetics，2001，17（4）：193－199.

［9］ Li J D，Carroll J，Ellar D J.Crystal structure of insecticidal delta－endotoxin fromBacillus thuringiensis at 2.5Aresolution［J］.Nature，1991，353（6347）：815－821.

［10］ Grochulski P，Masson L，Borisova S，et al.Bacillus thuringiensis CryIA（a）insecticidal toxin：crystal structure and channel formation［J］.Journal of Molecular Biology，1995，254（3）：447－464.

［11］ Morse R J，Yamamoto T，Stroud R M.Structure of Cry2Aa suggests an unexpected receptor binding epitope［J］.Structure，2001，9（5）：409－17.

［12］ Galitsky N，Cody V，Wojtczak A，et al.Structure of the insecticidal bacterial delta－endotoxin Cry3Bb1of Bacillus thuringiensis［J］.Acta Crystallography D Biological Crystallography，2001，57（8）：1101－1109.

［13］ Boonserm P，Davis P，Ellar D J，et al.Crystal structure of the mosquito－larvicidal toxin Cry4Ba and its biological implications［J］.Journal of Molecular Biology，2005，348（2）：363－382.

［14］ Boonserm P，Mo M，Angsuthanasombat C，et al.Structure of the functional form of the mosquito larvicidal Cry4Aa toxin fromBacillus thuringiensis at a 2.8－angstrom resolution［J］.Journal of Bacteriology，2006，188（9）：3391－3401.

［15］ Guo S，Ye S，Song F.Crystal structure of Bacillus thuringiensis Cry8Ea1：An insecticidal toxin toxic to underground pests，the larvae of Holotrichia parallela［J］.Journal of Structural Biology，2009，168：259－266.

［16］ 赵新民，夏立秋，王发祥，等.苏云金芽孢杆菌毒素Cry1Aa、Cry2Aa、Cry3Aa和Cry4Aa结构的计算机对比分析［J］.化学学报，2008，66（1）：108－111.

［17］ Bravo A，Likitvivatanavong S，Gill S S，et al.Bacillus thuringiensis：A story of a successful bioinsecticide［J］.Insect Biochemical and Molecular Biology，2011，41（7）：423－431.

［18］ 王发祥，夏立秋，丁学知，等.W544F定点突变提高Cry1Ac蛋白的稳定性［J］.高等学校化学学报，2008，29（10）：1999－2002.

［19］ Wang F X，Xia L Q，Ding X Z，et al.N546inβ18－β19loop is important for binding and toxicity of the Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2009，101（2）：119－123.

［20］ De Maagd R A，Bravo A，Berry C，et al.Structure，diversity and evolution of protein toxins from spore－forming entomopathogenic bacteria［J］.Annual Review of Genetics，2003，37：409－33.

［21］ 赵新民，夏立秋，王发祥，等.重组杀蚊苏云金芽孢杆菌研究进展［J］.中国生物防治，2007，23（1）：77－82.

［22］ Li J，Koni P A，Ellar D J.Structure of the mosquitocidal delta－endotoxin CytB from Bacillus thuringiensis subsp.kyushuensis and implications for membrane pore formation［J］.Journal of Molecular Biology，1996，257（1）：129－152.

［23］ Cohen S，Dym O，Albeck S，et al.High－resolution crystal structure of activated Cyt2Ba monomer fromBacillus thuringiensis subsp.israelensis［J］.Journal of Molecular Biology，2008，380（5）：820－827.

［24］ Butko P，Huang F，Marianne P C，et al.Interaction of the delta－endotoxin CytA from Bacillus thuringiensis var.israelensis with lipid membranes［J］.Biochemistry，1997，36（42）：12862－12868.

［25］ Charles J F，Nielsen－LeRoux C，Delecluse A.Bacillus sphaericus toxins：molecular biology and mode of action［J］.Annual Review of Entomology，1996，41：451－472.

［26］ Parker M W，Buckley J T，Postma J P M.et al.Structure of the Aeromonastoxin proaerolysin in its water－soluble and membrane－channel states［J］.Nature，1994，367（6460）：292－295.

［27］ Rang C，Lacey L A，Frutos R.The crystal proteins fromBacillus thuringiensis subsp.thompsoni display a synergistic activity against the codling moth，Cydia pomonella［J］.Current Microbiology，2000，40（3）：200－204.

［28］ Naimov S，Boncheva R，Karlova R，et al.Solubilization，activation，and insecticidal activity of Bacillus thuringiensis serovar thompsoni HD542crystal proteins［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（23）：7145－51.

［29］ Broadwell A H，Baumann P.Sporulation－associated activation of Bacillus sphaericus larvicidal toxins［J］.Applied and Environmental Microbiology，1986，52（4）：758－64.

［30］Donovan W P，Donovan J C，Slaney A C.Bacillus thuringiensis cryET33and cryET34compositions and uses therefor：U.S.［P］.6063756，2000－09－24.

［31］ Ellis R T，Stockhoff B A，Stamp L，et al.Novel Bacillus thuringiensis binary insecticidal crystal proteins active on western corn rootworm，Diabrotica virgifera virgifera LeConte［J］.Applied and Environmental Microbiology，2002，68（3）：1137－1145.

［32］ Jones G W，Nielsen－Leroux C，Yang Y，et al.A new Cry toxin with a unique two－component dependency from Bacillus sphaericus［J］.FASEB Journal，2007，21（14）：4112－4120.

［33］ Li X Q，Wei J Z，Tan A，et al.Resistance to root－knot nematode in tomato roots expressing a nematicidal Bacillus thuringiensis crystal protein［J］.Plant Biotechnology Journal，2007，5（4）：455－464.

［34］ Marroquin L D，Elyassnia D，Griffitts J S，et al.Bacillus thuringiensis（Bt）toxin susceptibility and isolation of resistance mutants in the nematode Caenorhabditis elegans［J］.Genetics，2000，155（4）：1693－1699.

［35］ Xia L Q，Zhao X M，Ding X Z，et al.The theoretical 3D structure of Bacillus thuringiensis Cry5Ba［J］.Journal of Molecular Modeling，2008，14（9），843－848.

［36］ 余子全.苏云金芽胞杆菌杀线虫蛋白基因cry6Aa的表达负调控及杀线虫蛋白进入根结线虫体内的模式［D］.武汉：华中农业大学，2008.

［37］ Payne J M，Kennedy M K，Randall J B，et al.Bacillus thuringiensis toxins active against hymenopteran pests：U.S.［P］.5596071，1997－01－21.

［38］ Mizuki E，Park Y S，Saitoh H，et al.Parasporin，a human leukemic cell－recognizing parasporal protein of Bacillus thuringiensis［J］.Clinical Diagnostic Laboratory Immunology，2000，7（4）：625－634.

［39］ Okumura S，Ohba M，Mizuki E，et al.Parasporin nomenclature［EB／OL］.（2011－9－18）［2002－06－12］.http：∥parasporin.fitc.pref.fukuoka.jp／.

［40］ Yamashita S，Katayama H，Saitoh H，et al.Typical three－domain Cry proteins of Bacillus thuringiensis strain A1462exhibit cytocidal activity on limited human cancer cells［J］.The Journal of Biochemistry，2005，138（6）：663－672.

［41］ Okumura S，Saitoh H，Ishikawa T，et al.Mode of action of parasporin－4，a cytocidal protein from Bacillus thuringiensis［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2011，1808（6）：1476－1482.

［42］ Ito A，Sasaguri Y，Kitada S，et al.A Bacillus thuringiensis crystal protein with selective cytocidal action to human cells［J］.The Journal of Biological Chemistry，2004，279（20）：21282－21286.

［43］ Zhang W，Crickmore N，George Z，et al.Characterization of a new highly mosquitocidal isolate of Bacillus thuringiensis－an alternative to Bti？［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2012，109（2）：217－222.

［44］ 宋萍，郭丽伟，苏俊平，等.一株含cry新基因的苏云金杆菌菌株的研究［J］.华北农学报，2011，26（1）：54－57.

［45］ Zheng A，Zhu J，Wang L，et al.Characterization and expression of a novel holotype insecticidal crystal protein gene from native Bacillus thuringiensis BM59－2［J］.Canadian Journal of Microbiology，2010，56（2）：156－161.

［46］ Bravo A，Gómez I，Porta H，et al.Evolution of Bacillus thuringiensis Cry toxins insecticidal activity［J］.Microbial Biotechnology.First published online：29MAR 2012，DOI：10.1111／j，1751－7915.2012.00342.x.