安全剂R－28725保护玉米免受氯磺隆药害的作用

赵李霞， 刘程国， 付 颖， 高 爽， 叶 非

（东北农业大学理学院，哈尔滨 150030）

磺酰脲类除草剂由美国杜邦公司在20世纪80年代开发，是世界上品种最多、研究最为深入的一类除草剂，以高效、低毒、高选择性的特性在全世界范围内得到广泛使用［1］。磺酰脲类除草剂在使用过程中最突出的问题就是对后茬作物的残留药害［2］。近年来，全球报道了多起因使用磺酰脲类除草剂导致作物发生药害的事故，尤其是超高效磺酰脲类除草剂氯磺隆，在土壤中残留期较长，不易挥发和光解的特点，对后茬作物药害严重，导致后茬的水稻、玉米或棉花受到药害［3－4］。

针对磺酰脲类除草剂使用中的问题，人们提出使用安全剂来解除该类除草剂对作物的药害［5］。Behringer等发现在苗后应用安全剂双苯恶唑酸和吡唑解草酯，能够有效提高谷类作物对磺酰脲类除草剂的耐受性，使作物免受磺酰脲类除草剂的伤害［6］。郭玉莲研究表明安全剂NA可通过诱导玉米体内乙酰乳酸合成酶（ALS）、谷胱甘肽－S－转移酶（GST）活性，减轻氯嘧磺隆残留对玉米的药害［7］。叶非等人采用生物测定的方法研究安全剂AD－67保护玉米和高粱免受单嘧磺隆药害的作用机理，结果表明：AD－67能够提高单嘧磺隆处理后作物幼苗中的谷胱甘肽（GSH）含量和ALS活性，促进单嘧磺隆与GSH的轭合作用［8－9］。研究者普遍认为：安全剂能提高作物体内GSH水平和GST活性，促进GSH与磺酰脲类除草剂活性部位轭合，解除除草剂对靶标酶的抑制，从而达到解毒的目的［10］。目前针对氯磺隆的安全剂研究刚刚起步，关于其作用机制的研究主要集中在对作物体内GSH含量的影响，安全剂对氯磺隆作用的生理过程、解毒酶GST活性、动力学参数等的影响尚无报道，其确切的作用机制仍未阐明。

除草剂安全剂 R－28725（3－二氯乙酰基－2，2－二甲基－1，3－噁唑烷）是二氯乙酰基噁唑烷类化合物，是酰胺类和硫代氨基甲酸酯类除草剂良好的解毒剂，也是潜在的磺酰脲类除草剂在禾本科作物田中的安全剂。本文通过生物测定方法研究了R－28725保护玉米免受除草剂氯磺隆药害的作用，初步探讨了保护作用的机理。

1 材料与方法

1.1 材料

供试药剂：20% 氯磺隆可湿性粉剂，江苏溧阳市化工厂；R－28725，本课题组合成；TCA（三氯乙酸），北京顺义永遂化工厂；DTNB（5，5－二硫代双乙硝基甲酸）、TPP（硫胺素焦磷酸）、DTT（二硫代苏糖酸醇）、GSH，Sigma化学试剂有限公司。

供试玉米品种：‘东农253’，东北农业大学农学院提供。

试验土壤：取自东北农业大学实验田1～15cm无污染的耕层土壤，过筛、自然风干后使用。土壤pH为7.37，有机质含量为2.37%。

仪器：ZRX－300D智能人工气候培养箱（杭州钱江仪器设备有限公司）；T6新悦紫外－可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Sigma 3K30离心机（德国希格玛离心机有限公司）；0K－98－ⅡA电热恒温水浴锅（天津市泰新特仪器有限公司）。

1.2 作物生长条件

取定量过2mm筛的风干土，加入氯磺隆，配制成0、2μg／kg的毒土，装入纸杯。将精选的玉米种子用温水浸泡30min，0.6%多菌灵浸泡30min，蒸馏水冲洗干净后，用 R－28725溶液（0、5mg／kg）浸种12h，蒸馏水清洗干净后，在培养箱内催芽24h。选择芽长一致的玉米种子7粒，均匀摆放在药土表面，上覆药土，放置培养箱内培养（温度26.5℃、湿度75%、光照与黑暗各12h循环培养）。每个处理浓度播种两个纸杯。生长7d后，用于各生理指标的测定，数据采用SPSS 16.0系统处理。各处理重复3次。

1.3 GSH含量测定

取玉米幼苗的根0.2g，加1.2mL 5% 的TCA，在0～4℃下研磨，15 000g离心20min，取0.8mL离心后的上清液放入试管，加入1.6mL的磷酸钾缓冲液（0.5mol／L，pH ＝8），加入16μL 10mmol／L的 DTNB显色，在412nm 下测定A 值［11］。

1.4 GST活性以及动力学参数测定

取玉米幼苗的根0.2g，加入1mL GST酶提取液在0～4℃下研磨，15 000g离心20min，上清液为待测酶液。

取0.5mL 3.0mmol／L GSH，加入2.3mL磷酸钾缓冲液（0.1mol／L，pH ＝ 6.5），加入10μL上述待测酶液，最后加入20mmol／L溶于96%乙醇的CDNB 0.15mL，340nm 反 应5min，每隔1min测定 A 值［12］。

25μL的CDNB（0.1～48mmol／L），900μL磷酸钾缓冲液（0.1mol／L，pH ＝ 6.5），25μL的酶提取液，50μL的 G SH（100mmol／L，pH＝7.0），总体积1mL。GSH和CDNB的反应产物可在分光光度计340nm下测定以计算GST活性。通过1／Vvs.1／S作图，根据交点计算动力学参数Vmax和Km［13］。

1.5 ALS的提取和活性测定

ALS的提取：取1.0g玉米幼苗的叶，加入3.0mL ALS酶提取液，在0～4℃下研磨，25 000g离心20min，取上清液2.0mL用提取液定容至5.0mL。加入（NH4）2SO4粉末1.5g，振荡均匀。沉降2h后，25 000g离心20min，弃去上清液，将沉淀溶于3.0mL酶溶解液中，即为酶提取液。

ALS酶活性测定：取0.4mL酶提取液，加入0.1mL磷酸钾缓冲液（0.05mol／L，pH ＝7），再加入0.5mL酶反应液，放入35℃恒温水域中暗反应1h，加入0.1mL 3mol／L的 H2SO4终止反应，置于60℃恒温水浴中脱羧反应15min，然后加入0.5mL 0.5%的肌酸和0.5mL 5%甲萘酚，60℃显色15min，冷却后于525nm测定A值［14］。

蛋白质测定方法采用考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白做标准曲线［15］。

2 结果与讨论

2.1 R－28725对玉米GSH含量的影响

使用R－28725浸种处理和氯磺隆毒土处理对玉米根部GSH含量的影响见表1。氯磺隆毒土处理使玉米GSH含量下降至对照的57.3%；使用R－28725浸种处理后，GSH含量恢复至空白的83.4%。结果表明：R－28725有效缓解了氯磺隆对玉米根部GSH含量的抑制作用。

表1 R－28725对玉米根部GSH含量的影响1）Table 1 Effects of R－28725on the GSH content of maize roots

除草剂在作物体内的一个重要降解途径是与GSH轭合形成低毒或无毒的轭合物，然后通过体内的运输系统转运到细胞外或液泡，有效避免除草剂对作物造成的伤害［16］。因此作物体内的GSH含量在一定程度上决定着安全剂对除草剂的解毒程度。R－28725能够提高玉米中GSH含量，促进GSH与氯磺隆轭合，解除氯磺隆在玉米体内的活性，从而达到保护玉米免受氯磺隆药害的目的。

2.2 R－28725对玉米GST活性的影响

使用R－28725浸种处理和氯磺隆毒土处理对玉米根部的GST酶活性影响见表2。用氯磺隆毒土处理时，玉米的GST酶活性比空白提高了5.1%；使用R－28725浸种处理后，玉米的GST酶活性比空白提高了191.8%，与对照相比差异显著。

表2 R－28725对玉米根部GST酶活性的影响1）Table 2 Effects of R－28725on the GST activity of maize roots

1）表内数据为3次重复的平均值，同列数据后字母不同表示差异显著。The data were the means of 3replicates；different letters in the same column indicate different significance levels of the difference.

GST可以催化GSH与各种内源性和外源性化合物发生轭合，保护细胞不受氧化作用破坏，是作物体内重要的解毒酶之一。氯磺隆作为外源化合物能诱导作物体内GST活性增加，激发作物的自身抗逆功能；而R－28725可以大幅诱导玉米根部GST活性的增加，极大地提高作物体内GSH与外源物的轭合水平，从而达到对氯磺隆的解毒目的。R－28725对玉米体内GST酶活性和GSH含量的影响结果相一致，说明GSH轭合反应是在GST催化下进行的，即R－28725能够提高GSH含量和GST活性，有利于催化轭合反应的发生，从而快速解除除草剂氯磺隆对玉米的毒害作用［17］。

2.3 R－28725对GST酶促反应动力学参数的影响

使用R－28725浸种处理和氯磺隆毒土处理对GST酶的动力学参数Vmax和Km的影响见表3。氯磺隆毒土处理使Vmax减小40.5%，而R－28725浸种处理使Vmax增大102.5%。氯磺隆毒土处理使Km增大34.4%，而 R－28725浸种处理使 Km减小40.0%。结果表明：氯磺隆减小了GST酶对底物的亲和力，而R－28725明显增强了GST对底物的亲和力。安全剂R－28725通过增强GST对底物的亲和力，提高GST活性，能更好地催化GSH与除草剂氯磺隆的轭合反应，解除除草剂对作物的毒害。

表3 R－28725对玉米根部GST酶动力学常数的影响1）Table 3 Effects of R－28725on the GSTkinetic constants of maize roots

2.4 R－28725对玉米ALS酶活性的影响

使用R－28725浸种处理和氯磺隆毒土处理对玉米叶片ALS酶活性的影响见表4。单独用氯磺隆毒土处理，叶片中的ALS酶活性比空白降低了37.3%；用R－28725浸种处理后，ALS酶活性得到明显提高，比空白高出17.2%。R－28725能够显著提高玉米叶片中ALS酶活性，解除氯磺隆对玉米体内ALS酶的抑制，保护玉米免受氯磺隆药害。

表4 R－28725对玉米叶片中ALS酶活性的影响1）Table 4 Effects of R－28725on the ALS activity of maize roots

ALS是磺酰脲类除草剂作用的靶标酶，氯磺隆可大大降低植物体内ALS酶活性，抑制缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成，阻碍细胞分裂期间DNA的形成，使有丝分裂停止，细胞不能正常生长，植物正常生长受到破坏而死亡［18］。

3 结论

2μg／kg氯磺隆毒土处理对玉米的GSH含量和ALS活性产生了抑制作用；使用R－28725浸种处理可以基本解除氯磺隆对玉米生理指标的抑制作用。结果表明：R－28725通过提高作物体内GST活性，促进GSH与除草剂的轭合反应，这是R－28725减轻除草剂氯磺隆对玉米药害的重要途径之一；同时R－28725能够激活除草剂靶标酶ALS活性，逆转除草剂对靶标酶的抑制作用，从而达到解毒目的。

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