野生二粒小麦叶枯病病原菌鉴定及抗病基因遗传特性的初步研究

刘鑫燕， 高 涛， 王 粲， 吴立伟， 汪 昕， 周 蓉， 余春梅

（南通大学生命科学学院，南通 226019）

小麦叶枯病（wheat leaf blight and spot）是引起小麦叶斑和叶枯类病害的总称，世界上报道的叶枯病的病原菌达20多种，而壳针孢叶枯病（Septoria leaf blotch）、小麦链格孢叶枯病（Alternaria leaf blight）、小麦黄斑叶枯病（tan spot）等已经成为我国小麦生产的重要病害［1］。小麦感染叶枯病病菌后，常造成叶片早枯，影响籽粒灌浆，造成穗粒数减少，千粒重下降，有些叶枯病原菌还可引起籽粒的黑胚病［2］，降低小麦产量以及小麦商品粮等级。

链铬孢属（Alternaria）中有多种病菌能引起小麦的叶枯病害。20世纪60年代曾在印度发生过链格孢属的A.triticina引起的病害流行，导致大约60%～75%小麦减产。王春江等［3］和商鸿生等［4］的研究认为，链格孢叶枯病在20世纪70年代就已经在我国的一些育种苗圃中发生，并曾在1997－1998年间，在黄河中下游和江淮麦区有较大面积的发生。由于高温高湿条件有利于叶枯病的发生，我国黄河中下游、江淮麦区、长江流域以及西南麦区在小麦生育期的中后期通常会遭遇高温高湿气候，为叶枯病的大发生提供了可能的环境条件。与小麦常见的赤霉病、白粉病等相比较，该病在我国的出现相对较晚且对该病的认识尚处在起步阶段。邢小萍等［5］2005－2007年度对河南省主栽小麦品种叶枯病田间发病情况进行调查，发现没有对叶枯病免疫的品种。尽管该调查并未说明致病病菌，但至少说明了叶枯病的发生在我国小麦生产中可能具有普遍性。因此，在发生叶枯病栽培区域，鉴定引起叶枯病症状的病原菌种类，研究小麦中抗病基因的抗性遗传规律，鉴定抗病基因资源，并进一步应用于育种实践将具有积极意义。

本试验根据科赫氏法则，从具有叶枯病症状的四倍体野生二粒小麦上分离了致病菌，通过孢子形态和核糖体rDNA内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）分子进化分析对病原菌进行了鉴定。在离体无菌条件下，对抗病与感病亲本以及其杂交所得的200多个F2∶3家系进行了抗病性鉴定，初步解析了抗病基因的遗传规律，为进一步通过分子标记定位抗病基因以及开展分子标记辅助育种奠定了研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

四倍体野生二粒小麦（Triticum dicoccoides，2n＝28，AABB）亲本‘JIC106003’以及‘JIC106007’引自中国科学院遗传发育所植物细胞与染色体国家重点实验室。本实验室于2008年配置杂交组合，并于2009－2011年分别对F1、F2单株及F2：3家系进行了抗病性鉴定。供试叶枯病病原菌由本实验室分离保存。

1.2 病原菌的分离纯化

在试验地取苗期（四叶期）至抽穗期的发病叶片，剪成5cm左右的小段用75%乙醇浸泡3min，无菌水冲洗1次，放入1%次氯酸钠中浸泡30s，无菌水冲洗3次。吸取100μL最后一次洗涤用水涂布于PSA固体培养基作为无菌对照。将表面消毒的叶片，从发病区域剪取5mm×5mm大小放PSA固体培养基表面，置于28℃的培养箱内培养并观察。将获得的真菌进行纯化后，用透明胶带法［6］对分离到的菌丝进行制片，并用石炭酸棉兰染液染色后进行镜检。

1.3 病原性试验

按李大海等［7］的方法进行病原性试验。首先对健康叶片进行表面消毒（同1.2），并在叶片上滴加2滴20μL真菌孢子悬浮液［（4.0～5.0）×103个／mL］，放置在光照培养箱中（24℃，12h光照）。接菌后的48h内叶片基本无病斑发展，48h后病斑逐渐发展，将能在感病亲本中发病的菌株进一步培养后用于后续的分子生物学鉴定和F2∶3家系抗病性调查。

1.4 病原菌DNA的提取

用真菌基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝），并按其说明书进行病原菌基因组DNA的提取。

1.5 病原菌的分子鉴定以及菌落类群分析

根据 White等［8］的报道，用跨5.8rDNA基因两侧 ITS 的 引 物 ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGAT ATGC－3′分 别 与 ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′和 ITS5：5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′配对扩增，PCR反应体系为20μL，总体积中加入10ng／μL模板1μL，10×LATaq（大连宝生物）缓冲液2μL，10μmol／L上下游引物各0.2μL，2.5mmol／L的 dNTPs 2μL，适量灭菌双蒸馏水。95℃变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环后，72℃延伸10min进行PCR扩增。产物用1% 琼脂糖凝胶进行电泳检测。并将ITS4与ITS1和ITS5配对扩增产物分别回收（鼎国公司PCR产物纯化试剂盒），连接克隆于pMD18－T载体（大连宝生物），阳性菌落送上海Invitrogen公司测序。

在GenBank查找Vergnes等［9］报道的相关序列，以E.pedicillatum 作为外类群，使用Clustal W2进行多序列比对，MEGA5.0软件中Neighbor－Joining（NJ）法进行建树，Bootstrap值设为500。

1.6 遗传群体中抗病性调查及评价方法

离体叶鉴定根据病斑反应型和严重度来确定供试材料的抗性。参照李大海等［7］的方法，进行病情调查和抗性分析。

按以下公式计算每个单株的病情发展曲线下面积（area under the disease progress curve，AUDPC）。AUDPC＝∑［（Xi＋Xi＋1）／2］（ti＋1－ti）。式中的Xi和Xi＋1分别是第i次记载和第i＋1次记载的严重度，ti＋1－ti是第i＋1次记载和第i次记载之间所间隔的时间。本研究根据病斑的发展，从接种72h后开始记录病情，间隔24h，连续记录3次。

1.7 抗病基因遗传特性的鉴定

根据亲本、F1、F2单株田间自然发病情况以及F2：3家系实验室接种病情统计，应用质量性状的分离规律和适合度（χ2）检测抗病基因数目。

2 结果与分析

2.1 野生二粒小麦叶枯病表型

根据2007－2009年亲本的抗病表型，抗病野生二粒小麦在自然条件下叶片无病斑（图1a），感病野生二粒小麦叶片出现椭圆形的褪绿小斑，后病斑连接成片，中间有黑色至褐灰色，边缘黄色。感病材料的叶片从基部直至倒二叶均有不同程度的病斑，第2片叶基本坏死，第3叶有较大面积的病斑，上部4～6叶病斑较轻（图1b）。根据龙宗权［1］、商鸿生等［3］的研究，初步判断是由链格孢叶枯病病菌引起的病害。根据田间叶枯病情况，选择‘JIC1060003’（抗）和‘JIC1060007’（感）作为亲本配置了杂交并获得了遗传群体。

2.2 菌的形态鉴定

使用贴片法在PSA培养基平板上共分离到两种真菌以及酵母。通过科赫氏法则及叶片病原菌的活体（in vivo）观察（图2a）显示只有一种真菌为叶枯病的致病菌。按1.3中的方法进行叶片接种72h后，接种部位呈现褪绿，中心且有褐色斑点，并在显微镜下观察到菌丝（图2a）。菌株在PSA平板上生长速率为0.5～0.6cm／d，菌落第2～3天为白色，之后中央出现灰黑色区域，气生菌丝白色绒毛状。镜检发现，其分生孢子梗单生或丛生，直立，黄褐色，大小为（17～27）μm ×（3～6）μm （图2c）。分生孢子单生或2～4个串生，褐色，卵圆形或椭圆形，喙较短，大小（15～89）μm ×（7～30）μm，1～6个横膈膜，1～4个纵隔膜。根据 Andersen［3－4，10］等人的描述，此菌属于链格孢菌属，但其种的特性需进一步鉴定。

图1 野生二粒小麦叶枯病表型Fig.1 Phenotypes of the leaf blight and spot in Triticum dicoccoides

图2 从感病叶片中分离的叶枯病病菌表型特征Fig.2 Morphology of the pathogen isolated from leaves of the susceptible genotype of T.dicoccoides‘JIC1060007’

2.3 病菌的分子生物学鉴定

为了进一步确认所分离的链格孢菌的类群，对核糖体5.8SrDNA以及侧翼转录间隔区进行了扩增和进化分析。两对真菌通用引物（ITS1、ITS4，ITS4、ITS5）PCR扩增的产物，用1%琼脂糖电泳检测，500～750bp间有明显的扩增条带，且ITS1、ITS4产物长度稍小于ITS4、ITS5（图3a，泳道5～8）。进一步对ITS4、ITS5产物进行克隆测序后显示其长度为595bp。按1.5中的方法进行进化分析。尽管本试验中所测序列有单个核苷酸的差异（以ITS5－1，6和10三个代表克隆），但均属于A.alternata类群（图3b）

图3 病菌5.8SrDNA基因及其侧翼ITS序列的检测以及链格孢属不同种的进化分析Fig.3 Detection and phylogeny analysis of 5.8SrDNA gene and flanking ITS sequence

2.4 遗传群体F2∶3家系中叶枯病表型鉴定以及抗病基因的遗传特性分析

用本实验室分离的具有致病性的病原菌，在实验室条件下接种母本‘JIC106003’和父本‘JIC106007’以及252个F2∶3家系小麦，按1.6中的方法对病级进行了分类。在群体中植株表现为抗病的有64株系（图4a，e），中抗的有128株系（图4b），中感的有51株系（图4c），感病的有8株系（图4d）。

图4 F2∶3家系中抗病性鉴定的表型特性以及AUDPC分布Fig.4 Different resistant phenotype to the pathogen among F2∶3family lines and the distribution of the AUDPC in F2∶3family lines

AUDPC分析表明，亲本‘JIC1060003’AUDPC为839.98，表现为中等抗病；‘JIC1060007’AUDPC为2592，表现为高感，F1单株的AUDPC平均983.58（2009年数据），与F2∶3家系平均数928.41接近。根据F1的表型，初步推测亲本‘JIC106003’中的抗性基因为显性基因。F2∶3家系中的AUDPC分析表明（图4e），部分株系表现为超亲抗性（如67株AUDPC为0～500，小于抗性亲本‘JIC1060003’），且抗性呈现偏态分布，以抗、中抗偏多。在F2：3家系中，以抗和中抗的株系数（193）对中感和感病的株系数（59，部分株系的AUDPC值接近1 500，表现为中感），χ2为0.256，符合一对性状分离规律 （P＞0.05，小于＝3.84），因此认为该亲本组合中存在一对主效的显性抗病基因。同时由于群体中的抗性存在超亲个体，因此双亲中可能还存在作用较小的数量性状和隐性的抗病基因，只有这些基因在后代中聚合且与抗性显性基因一起时才表现为超亲抗性。

3 讨论

本研究应用叶片病斑的形态观察，孢子形态显微观察、科赫氏法则以及分子进化分析等试验方法，证明了一株与链格孢属的Alternaria alternata较为接近的真菌是参试野生二粒小麦叶枯病的致病菌，并通过遗传学分析，表明抗病亲本‘JIC106003’亲本携带一对主效抗病基因，同时双亲中还可能存在数量性状和隐性的抗病基因。

有关小麦链格孢叶枯病，我国研究者［4］认为多种链格孢菌能引起叶枯病症状，并从菌丝和孢子的形态上进行了描述。在国际上，Vergnes等［9］从小麦上分离到的4种链格孢菌A.triticina、A.alternata、A.tenuissima 和A.arborescens，只有 A.triticina能引起少数四倍体硬粒小麦的叶枯病，尽管该菌曾经在20世纪60－70年代在印度引起大面积叶枯病，但后来的栽培品种对该菌都能免疫。该研究同时通过ITS1、5.8SrDNA和ITS2区序列比较对上述4个种进行了分子进化分析，来自A.triticina的序列与其他3种有明显区分，其他3种序列也能各自聚类，说明能用该区的序列区分上述4种链格孢菌。因各地环境条件的差异，本试验首先按照科赫氏法则严格进行了病原菌的分离、再接种与再分离和再接种等试验环节，证明了所分离的菌种确实引起供试品种的叶枯病症状，且通过两次PCR扩增ITS1、5.8SrDNA和ITS2区域进行克隆测序，序列相似性99.9%以上，证明了所获得的菌落是单菌落。根据Vergnes等［9］提交的序列，本研究中分离的链格孢序列属于A.alternata类群（图3b）。因Vergnes等［9］只提交了4种小麦链格孢菌株的序列，而王洪凯等［11］对多种链格孢属种的研究认为，ITS1、5.8SrDNA和ITS2区域序列无法在种的水平上对链格孢属进行区分，因此本研究分离的菌株与Vergnes等的A.alternata供试菌株的区别尚待进一步研究。

通过在实验室可控条件下接种小麦叶片，表现出的病情排除了自然环境条件不稳定的因素，试验获得的数据更能接近基因型的实际表现。经过F1和F2：3家系病情分析，表明抗A.alternata叶枯病基因较为复杂，存在主效显性抗病基因的同时还存在微效抗病基因，且可能以隐性的方式存在。为了进一步鉴定抗病基因的遗传规律，回交群体的创制正在进行中。

［1］ 龙宗权.小麦3种叶枯病的识别与防治［J］.农技服务，2008，25（3）：39－40.

［2］ Chalkley D.Systematic mycology and microbiology laboratory，ARS，USDA.Invasive Fungi.Alternarialeaf blight of wheat－Alternaria triticina［EB／OL］.August 30，2010，http：∥nt.ars－grin.gov／sbmlweb／fungi／index.cfm.

［3］ 王春江，商鸿生.小麦叶疫病的诊断和病原菌鉴定［J］.植物保护，1999，25（6）：19－20.

［4］ 商鸿生，王春江，王树权.小麦链格孢叶枯病的病原学研究［J］.植物病理学报，2000，30（2）：129－132.

［5］ 邢小萍，汪敏，宋爽，等.不同小麦品种（系）叶枯病田间发病情况及抗性评价［J］.甘肃农业大学学报，2009，44（6）：102－106.

［6］ 沈萍，陈向东.微生物学实验［M］.第4版.北京：高等教育出版社，2007：73－74.

［7］ 李大海，常迺滔，白丹，等.小麦抗蠕孢菌叶枯病（HLB）遗传的初步研究［J］.植物保护，2008，30（4）：60－64.

［8］ White T J，Bruns T，Lee S，et al.Amplification and direct sequencing of the fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.PCR Protocals：A guide to methods and applications［M］.Academic Press，Inc，1990：315－322.

［9］ Vergnes D M，Renard M E，Duveiller E，et al.Identification of Alternaria spp.on wheat by pathogenicity assays and sequencing［J］.Plant Pathology，2006，55（4）：485－493.

［10］ Andersen B，Krφger E，Roberts R G.Chemical and morphological segregation of Alternaria arborescens，A.infectoria and A.tenuissima species－groups［J］.Mycological Research，2002，106（2）：170－182.

［11］ 王洪凯，张天宇，张猛.应用5.8SrDNA及ITS区序列分析链格孢种级分类［J］.菌物系统，2001，20（2）：168－173.