不同龄期枝条对苹果轮纹病菌的抗病性研究

程自振， 赵 旭， 董向丽， 王彩霞， 刘晓凡， 李保华

（青岛农业大学农学与植物保护学院 山东省植物病虫害综合防控重点实验室，青岛 266109）

苹果枝干轮纹病［Botryosphaeriadothidea（Moug.ex Fr.）Ces.et de Not.］俗称粗皮病，是苹果枝干上发生的重要病害。严重发生时，可削弱树势，甚至造成枝干枯死［1］。近年来，随着‘富士’品种的大量栽培和套袋技术的应用，枝干轮纹病的危害逐年加重。据2008年国立耘等调查，我国苹果枝干轮纹病总体发病率达77.6%［2］。作为苹果树三大病害之一，轮纹病发生的轻重，成为影响我国苹果产业能否可持续发展的关键因素。

对于轮纹病，目前生产上以化学防治为主。研究枝条的生长发育期和龄期对轮纹病菌侵染的影响，可以明确轮纹病菌在枝条上的侵染期和侵染部位，有助于更深入地了解轮纹病的发生和流行规律，为轮纹病的化学防治提供更可靠的理论依据，同时，也对抗病品种的鉴定和选育具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 病原菌

试验所用轮纹病菌于2009年采自山东莱阳水沐头村的商用苹果园，为‘富士’苹果枝条病瘤上的单孢分离菌株，活化前在5℃的冰箱内保存。

接种前，先在PDA培养基上活化菌种，并接种‘富士’苹果的幼果，繁殖分生孢子［3］。将新鲜的分生孢子用纯净水配制成孢子含量105个／m L的悬浮液，加入0.1%的吐温20后备用。或将活化菌种继代培养5 d，用直径1.2 cm的打孔器从菌落边缘打取菌饼，直接用于枝条接种。

1.2 当年生枝条对轮纹病菌的抗病性

为了明确当年生苹果枝条在不同生长发育阶段对轮纹病菌的抗性，2011年6月下旬和7月下旬，在青岛农业大学试验果园内5年生的‘富士’苹果树上，用轮纹病菌分两批接种当年生‘富士’苹果枝条。接种时，选取10枝30～60 cm长的当年生、长势旺盛的健壮枝条，并标记。病菌接种采用喷雾法。用手持喷雾器将孢子悬浮液均匀地喷洒到接种标记枝条上，直到枝条上有孢子悬浮液流下为止。接种后迅速套上塑料袋，保湿24 h后解袋。接种后将接种枝条按长度均匀分成10段，从基部到梢部依次编号为1～10。

11月份，待接种枝条发病后，调查记录每一段枝条上的皮孔总数和发病的皮孔数。由于不同枝段上皮孔的密度差异较大，本研究以皮孔的发病率作为枝条抗侵入能力的评价指标。皮孔的发病率（%）＝100×该段发病皮孔数／该段总皮孔数。

1.3 不同龄期枝条对轮纹病菌的抗病性

为了研究不同龄期枝条对轮纹病菌的抗病性差异，2010年7月中旬和8月中旬，用轮纹病菌分两批对1～5年生的‘富士’苹果枝条进行了接种。接种试验在青岛农业大学试验果园内6年生的‘富士’苹果树上进行。接种时，分别选取1、2、3、4年和5年生枝条各10枝，并标记。每个龄期枝条要求长势旺盛、表面无病瘤和病斑，且接种点处粗度基本一致。接种前，在每个枝条的中部选取2个接种点，其中1年生枝条接种位置在枝条的中下部，两接种点之间的距离不小于5 cm，对接种区域表皮用70%的乙醇擦拭消毒，待乙醇完全挥发后，在两个接种点上分别用菌饼和蘸有孢子悬浮液的脱脂棉接种。其中上部接种点上粘贴菌饼，菌丝面紧贴枝条的表皮；下部接种点放蘸有孢子悬浮液的脱脂棉球。接种后立即用保鲜膜将菌饼和蘸有孢子悬浮液的脱脂棉球包严。5 d后去掉保鲜膜，解除保湿。

次年6月，待接种枝条全部发病后，在菌饼接种的部位，以接种点为中心，选取直径1.5 cm圆形区域用记号笔标出，调查该区域内皮孔总数和产生轮纹病瘤的皮孔数。在用分生孢子接种的部位，以发病最严重的区域为中心，对于1年生的枝条，量取2 cm的枝段，对2～5年生枝条量取2 cm×2 cm的正方形区域并标记，调查该枝段或区域内皮孔总数和产生轮纹病瘤的皮孔数，计算皮孔的发病率。

2 结果与分析

2.1 当年生枝条对轮纹病菌的抗病性

2011年6月下旬接种的当年生枝条自8月中旬开始发病，潜育期为50 d。7月下旬接种的当年生枝条自8月下旬开始发病，潜育期为30 d。进入11月份皮孔的发病率不再增加。两次接种枝条的皮孔发病率见表1。结果表明，在用轮纹病菌孢子接种的当年生‘富士’苹果枝条上，从基部到梢部，皮孔发病率逐渐升高，差异显著。其中，6月下旬接种的8个枝条中（2个接种枝条被折断），基部皮孔的平均发病率为37.51%，梢部皮孔的平均发病率为84.44%，从基部到梢部皮孔发病率有显著增加（P＜0.05）。7月下旬接种的10个枝条中，调查只剩8个枝条，8个枝条基部皮孔的平均发病率为32.38%，梢部皮孔的发病率为58.57%，皮孔发病率的增加趋势没有6月下旬接种枝条的增加趋势明显。6月下旬和7月下旬两次接种枝条皮孔的平均发病率分别为56.51%和43.64%，两者差异显著（P＜0.05）。

2.2 不同龄期枝条对轮纹病菌的抗病性

2010年7月中旬接种的枝条于9月开始出现病瘤。8月中旬接种的枝条于10月开始出现病瘤，但当年形成的病瘤数量很少，大部分病瘤都在次年5月产生，6月病瘤数量基本不再增加。2011年6月中旬调查接种枝条的皮孔发病率见表2。7月中旬，用菌饼和分生孢子接种的1～5年生枝条上，皮孔的平均发病率分别为16.75%和26.90%，不同龄期枝条上的皮孔发病率没有显著的差异（P＞0.05）。表明1～5年生‘富士’苹果枝条对轮纹病菌的抗侵染能力在7月中旬病菌接种时没有显著差异。8月中旬，用菌饼接种的枝条中，1年生枝条上的皮孔发病率为68.30%，显著（P＜0.05）高于4年生和5年生枝条上的发病率31.77%和27.23%；用分生孢子接种的枝条中，1年生和2年生枝条的发病率分别为66.04%和64.40%，显著高于5年生枝条的发病率30.89%。说明1年生‘富士’苹果枝条在8月中旬病菌接种时比5年生枝条更敏感，不同龄期的枝条对轮纹病菌的抗侵入能力存在一定差异。

表1 用轮纹病菌分生孢子接种当年生枝条的皮孔发病率1）Table 1 Percentage of diseased lenticels on new produce‘Fuji’apple shoots inoculated with conidia of Botryosphaeria dothidea

表2 在不同时期用孢子和菌饼接种‘富士’苹果1～5年生枝条的皮孔发病率1）Table 2 Percentage of diseased lenticels on 1－5 years’old‘Fuji’branches inoculated with conidia and mycelium of B.dothidea

3 结论与讨论

轮纹病菌的分生孢子和菌丝接种结果表明，当年生的‘富士’苹果枝条对轮纹病菌从皮孔或气孔侵入的抗性存在显著差异。新生枝条抗侵入能力差，对轮纹病菌敏感，随枝条的生长发育，抗病性逐渐增强，新生枝条生长至2个月后，达到成年枝条的抗性。从不同龄期的枝条接种轮纹病菌后皮孔的发病率可以看出，7月份，‘富士’苹果1～5年生成年枝条对轮纹病菌抗侵入的能力没有显著的差异。但8月份，1年生的低龄枝条对轮纹病菌的侵染比5年生的高龄枝条更敏感。

苹果轮纹病菌主要通过皮孔、伤口或表皮缝隙侵入枝干［4］。气孔和皮孔是轮纹病菌的主要侵染途径，从气孔和皮孔侵染的病原菌量约占轮纹病菌在枝干上总侵染量的92%，通过伤口及表皮缝隙侵染菌量，仅占轮纹病菌总侵染量的8%［5］。轮纹病菌在健康的枝条上主要从皮孔和气孔侵染，气孔和皮孔是阻止轮纹病菌侵染健康枝条的第一道屏障。

而新生枝条和幼果上只有气孔，没有皮孔，皮孔是在枝条或果实的生长后期由气孔发育而成。气孔由两个保卫细胞组成，内部为薄壁细胞。这一结构难以抵御轮纹病菌的侵染。发育成熟的皮孔有三层结构：上层覆盖死细胞层，其下为2～3层木栓化的细胞，内层为具有分生能力的薄壁组织。轮纹病菌只有穿透皮孔结构的木栓化细胞才能侵入皮层内部［6］。皮孔的发育是渐变的过程。皮孔发育初期，木栓组织还没有形成，对轮纹病菌的抗性较弱。皮孔发育中后期木栓层才形成［7］，皮孔的抗病性也逐渐增强。幼嫩枝条经2个月左右的生长发育，才能达到成熟枝条的抗性。

苹果枝条对轮纹病菌的抗侵染能力主要取决于皮孔的结构，如木栓化细胞层数、细胞大小和排列致密的程度等。对于同一苹果品种，无论枝条的龄期大小，成熟枝条上的皮孔结构基本一致，对轮纹病菌的抗侵入能力也不会有显著的差异。

然而，枝条为了保持正常呼吸，皮孔细胞就需要不断更新，而且随枝条的生长而扩大。皮孔内部的分生组织能不断地分化产生新的细胞，更新其木栓化细胞，而原有的木栓化细胞死亡脱落或覆盖在皮孔表面。皮孔细胞的更新，对其抗性影响不大。但是皮孔的生长与扩大对其抗侵染能力影响较大。8月份，1年生枝条比5年生枝条对轮纹病菌的侵染更加敏感，可能与皮孔的生长发育有关。8月份，当枝条迅速加粗生长时，皮孔自边缘产生新的薄壁细胞，并木栓化。在薄壁细胞完全木栓化之前，皮孔对轮纹病菌的侵染较为敏感。枝条加粗生长速度越快，皮孔新增面积也越大，对轮纹病菌的抗侵染能力就越差。与5年生枝条相比，1年枝条皮孔的结构变化更大，也就更容易遭受轮纹病菌的侵染。

本试验采用了孢子和菌丝两种方式接种，试验结果表明，用孢子接种的枝条发病率更高。在自然条件下，轮纹病菌主要以分生孢子和子囊孢子传播侵染，用孢子接种更接近于轮纹病菌的田间发病规律。用孢子接种用于抗性鉴定，更能准确地反映不同苹果品种对轮纹病菌的抗性。

苹果树的大部分枝条都在5月形成，7月以后逐渐成熟。因此，5－7月是当年生苹果枝条对轮纹病菌的最敏感时期，在生产实践中应注意这一时期枝干轮纹病的防治。在果实的生长发育过程中，其抗病性的变化是否也存在类似的现象，有待于深入研究。在苹果枝干上，只要有皮孔存在，就存在轮纹病菌侵染的可能，就不能忽视对轮纹病的防治，尤其是8月枝条迅速加粗生长期。

［1］董金皋.农业植物病理学［M］.北京：中国农业出版社，2007：253－256.

［2］国立耘，李金云，李保华，等.中国苹果枝干轮纹病发生和防治情况［J］.植物保护，2009，35（4）：120－123.

［3］冷伟峰，李保华，国立耘，等.苹果轮纹病菌诱导产孢方法［J］.植物病理学报，2009，39（5）：536－539.

［4］陈策.苹果果实轮纹病研究进展［J］.植物病理学报，1999，29（3）：193－198.

［5］李广旭，高艳敏，杨华，等.轮纹病菌在苹果枝干上侵入途径的扫描电镜观察［J］.果树学报，2005，22（2）：169－171.

［6］张高雷，李保华，董向丽，等.苹果轮纹病瘤组织形态研究［J］.植物病理学报，2011，41（1）：98－101.

［7］李广旭，沈永波，高艳敏，等.皮孔组织结构及密度与苹果枝干粗皮病发生的关系［J］.果树学报，2004，21（4）：350－353.