贵州省烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性

苏 凯， 桑维钧＊， 张新强， 潘滴滴， 王 慧

（1.贵州大学农学院，贵州山地农业病虫害重点实验室，贵阳 550000；2.甘肃省天水市秦州县林业局，天水 741000；3.贵州省镇远县农业局，镇远 557700）

烟草黑胫病是由烟草疫霉烟草变种（Phytophthoranicotianaevar.nicotianae）引起的毁灭性病害，是世界烟草生产中危害最为严重的病害。该病在我国各烟草产区大量发生，是仅次于烟草病毒病的病害，严重影响了烟草的产量和品质。该病害通常在潮湿、多雨条件下发病重，潜育期短，再次侵染次数多，传播与蔓延迅速，严重时烟株常成片死亡。目前，防治烟草黑胫病主要通过采用抗病品种、栽培防治、化学防治等措施，其中化学防治是最普遍且实用的方法，但是病菌极易对杀菌剂产生抗性。

烯酰吗啉是防治疫霉属病害的高效内吸性杀菌剂，其作用为保护、治疗和抑制孢子产生［1］，对农作物上产生的霜霉病、疫霉病有很好的防治作用，其防治范围为马铃薯、番茄晚疫病，黄瓜、油菜霜霉病和辣椒疫病，烟草黑胫病等由鞭毛菌亚门卵菌纲引起的病害。该药对卵菌纲的作用特点是首先影响细胞壁分子结构的重新排列，然后干扰病原菌细胞壁聚合体的组装，从而干扰细胞壁的形成和促使孢子囊壁的分解，使病原菌出现自动死亡［2］，因此分析研究对贵州省烟草黑胫病病菌烯酰吗啉的敏感性，明确贵州省各烟草产区抗药菌的分布和抗药性水平，为烟草黑胫病的防治提供科学依据具有重要的实践意义。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离与纯化

将贵州省境内各烟区采集的新鲜烟草黑胫病标本用自来水冲洗干净，晾干，剖开茎基部发病部位，取病健交界处的病组织切成2 mm×2 mm左右大小，沿培养皿周缘直接置于含抗菌素的V8汁选择性培养基表面，每皿（直径9 cm）6～10块。在28℃下培养3～7 d，待菌落形成后，进行镜检，选择菌丝无隔膜的继续培养，待产生孢子囊后，镜检观察，鉴定。然后再从菌落边缘切取2 mm×2 mm的菌丝块转移至盛有V8培养基的试管斜面上，25℃黑暗培养7 d后，常温保存备用。

按照郑小波的方法［3］，将产生有大量孢子囊的菌丝或菌丝块挑入盛有10 mL左右灭菌自来水的培养皿中，培养皿置于4～10℃冰箱中10 min左右后，取出置于适温（20～25℃）下20 min，在显微镜下可以看到有大量游动孢子释放。在冷却凝固的0.2%V8培养基平板上（培养皿直径9 cm）滴加游动孢子悬浮液100～200μL，约含游动孢子200～500个，均匀涂布于培养基平板表面。培养皿置于室温下（25℃左右）、黑暗中培养24 h左右，使游动孢子休止萌发，并在培养基上形成微小菌落。并在显微镜下观察；然后在显微镜下用灭菌刀片切取带有单个已萌发游动孢子的琼脂块于选择性培养基平板上，在25℃黑暗条件下培养2～3 d后可获得单游动孢子的无性系。

1.2 烟草黑胫病菌菌丝生长对烯酰吗啉的敏感性测定

供试烯酰吗啉由江苏辉丰农化股份有限公司生产，有效成分为50%水分散粒剂；先用无菌水配成浓度为10 mg／m L的母液备用。

将黑胫病菌接种于V8培养基上，25℃下黑暗培养5 d后，用直径5 mm的灭菌打孔器在近菌落边缘处打孔。取适量已配好的烯酰吗啉母液，加入融化后即将凝固的V8培养基中，混匀，分别配制成浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0μg／m L V8培养基平板。待培养基冷凝后用接种针挑取菌碟，菌面向下接于含烯酰吗啉的培养基中心，每皿1块。接种后放入恒温箱中，每处理4皿，试验重复3次，25℃下培养5 d后用十字交叉法测量菌落直径。

按下式计算不同浓度药剂对黑胫病菌菌丝生长的抑制率：

计算抑制率几率值和浓度对数值并建立毒力回归方程，计算烯酰吗啉对黑胫病菌各菌株的抑制中浓度EC50及相关系数R［4］。数据统计用农药室内生物测定数据处理系统（武汉市蔬菜科学研究所，农业部农药检定所）。对42个菌株的EC50用SPSS程序进行正态分布检验，是否符合正态分布。根据王文桥等［5］的方法将菌株分为抗性菌株（EC50＞10μg／m L）、中间型菌株（0.1μg／m L≤EC50≤10μg／m L）和敏感菌株（EC50＜0.1μg／m L）。

1.3 烟草黑胫病菌游动孢子囊形成对烯酰吗啉的敏感性测定

参照Matheron等［6］的方法，从生长在V8平板上的黑胫病菌落边缘处打直径为5 mm的菌碟4块，然后分别置于含有0.0、0.5、1.0、2.0、4.0μg／mL烯酰吗啉的9 cm培养皿中（加入药液时要使液面刚刚没过菌碟块），25℃下光暗交替培养4 d后倒去无菌水，在菌碟上滴加少量酸性品红，1 min之后从菌碟的一侧慢慢滴加乳酸直至洗去大量品红［7］。在显微镜下可以看到游动孢子囊呈现红色，在菌碟上随机选取3个视野，在显微镜下对游动孢子囊进行计数（包括少量未被染红的游动孢子已出来的孢子囊），每处理3皿，重复3次，数据处理方法同菌丝生长抑制试验，计算菌株的EC50并进行正态分布检验。

2 结果与分析

2.1 烟草黑胫病菌的分离

从贵州省兴仁市屯脚镇、雨樟镇，兴义乌沙镇、白碗窑，晴隆县光照镇，开阳县羊场镇，福泉市黎山乡，余庆县松烟镇、熬溪镇，湄潭县抄乐乡、兴隆镇，遵义县三岔镇，铜仁市，大方县双山镇，纳雍县，长顺县，安龙县，水城县，黔西县林泉镇，毕节市等烟草黑胫病经常发生地区采集发病样本，经分离、纯化和鉴定后，总共得到47个烟草黑胫病菌菌株。

2.2 烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性水平

2.2.1 烟草黑胫病菌菌丝生长对烯酰吗啉的敏感性

采用菌丝生长速率法测定单孢分离得到的47个单孢菌株的EC50，结果（表1）发现大多数菌株属于中间型菌株，烟草黑胫病菌自然种群对烯酰吗啉没有明显的抗药性。

在黑胫病菌对药剂的敏感性变化范围内，将EC50等分为8个阶段，统计出每个阶段菌株的个数和频率，然后以每个阶段EC50的中值为横坐标，频率为纵坐标，作出频率分布图（图1），图中的峰代表病原菌群体对药剂的敏感性分布，发现烟草黑胫病菌丝对烯酰吗啉的敏感性呈单峰曲线，采用SPSS敏感性分布进行了K－S正态性检验，得到Z＝0.784，P＝0.571，表现连续性，则表明47个烟草黑胫病菌株对烯酰吗啉敏感性的频率分布符合正态分布。

表1 烟草黑胫病菌菌丝生长对烯酰吗啉的敏感性（贵州，2011年）Table 1 Sensitivity of mycelial growth of Phytophthora nicotianae var.nicotianae to dimethomorph（Guizhou，2011）

图1 烟草疫霉病菌47个菌株菌丝生长对烯酰吗啉敏感性的频率分布Fig.1 Frequency distribution of sensitivity of 47 P.nicotianae var.nicotianae isolates to dimethomorph

2.2.2 不同地区烟草黑胫病菌菌株对烯酰吗啉敏感性差异

采用Duncan氏新复极差法检验了烯酰吗啉对47个不同地区菌株EC50值的差异显著性。结果显示：47个菌株之间EC50值有极显著性差异（见表2）。EC50最高为兴仁屯脚的TJ1菌株，为4.232 7μg／mL，而开阳的KY2菌株EC50最低，只有0.792 6μg／mL，最高值与最低值相差5.34倍，供试47个菌株的平均EC50为2.476 8μg／m L（见表1）。表明贵州不同地区的黑胫病菌菌株对烯酰吗啉的敏感性不同。当烯酰吗啉的浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0μg／m L时，对耐药性最强菌株TJ1的抑制率分别为9.28%、21.20%、36.72%、46.00%，而对最敏感菌株 KY2的抑制率分别为：47.40%、51.39%、53.65%、60.59%，差异显著。

表2 烯酰吗啉对不同地区烟草黑胫病菌菌株EC50值的比较1）Table 2 The EC50 values of dimethomorph to different isolates of P.nicotianae var.nicotianae

2.2.3 不同地理来源菌株对烯酰吗啉敏感性水平的系统聚类分析

烯酰吗啉对47个供试菌株EC50值的离差平方和系统聚类分析结果（图2）表明：47个菌株的EC50值可分为由低到高的4个聚类组，第1组包括11个菌株（林泉2个，乌沙2个，屯脚3个，兴隆2个，遵义三岔1个）；第2组包括3个菌株（开阳2个，抄乐的1个）；第3组包括10个菌株（水城2个，长顺1个，遵义三岔1个，大方双山1个，屯脚2个，白碗窑1个，松烟1个，雨樟1个）；第4组包括23个菌株（雨樟1个，安龙2个，大方双山2个，福泉3个，毕节1个，白碗窑3个，松烟3个，晴隆2个，长顺2个，光照2个，抄乐1个）。大部分菌株出现在第3、4聚类组中，只有少部分菌株单独成一类，表明菌株对烯酰吗啉的敏感性和其地理来源有一定的相关性，从各系列菌株对烯酰吗啉敏感性的变化程度看，福泉、大方双山最大，林泉、开阳、屯脚、乌沙、兴隆的变化幅度最小，与Duncan新复极差法的分析结果一致［8］。

2.2.4 烟草黑胫病菌游动孢子囊形成对烯酰吗啉的敏感性

烯酰吗啉对47个烟草黑胫病菌游动孢子囊形成的EC50为0.394 5～4.625 3μg／m L（表3），平均EC50为2.040 0μg／m L。不同浓度的烯酰吗啉对烟草黑胫病菌孢子囊形成的影响表明：当烯酰吗啉浓度较低时，对不同菌株的产孢抑制率差异明显，如当烯酰吗啉浓度为0.5μg／m L时对菌株BWY3的抑制率为26.3%，而对菌株FQ4的抑制率则为40.4%。随着烯酰吗啉浓度的提高，菌株之间对烯酰吗啉的敏感性差异缩小。当烯酰吗啉浓度为8μg／m L时，其对烟草黑胫病菌的产孢抑制率已达100%，表明其可以完全抑制孢子囊的形成，随着处理浓度的提高，其抑制率差异逐渐缩小，结果见表3。

图2 不同地理来源菌株对烯酰吗啉敏感性水平的系统聚类分析Fig.2 Systemic cluster analyses of sensitivity level of isolates with different geographical origin to dimethomorph

采用SPSS敏感性分布进行了K－S正态性检验，得Z＝1.127，P＝0.076，同样表明游动孢子囊对烯酰吗啉的敏感性呈现出正态分布，结果表明烯酰吗啉对黑胫病菌的游动孢子囊有抑制作用，比对黑胫病菌菌丝的活性低或大致相等，但也出现了值相反的情况，其中BWY3、FQ1、KY1、QL1和全部的CL系列对游动孢子的EC50值明显大于对菌丝的，初步判断烟草黑胫病菌部分菌株的游动孢子已在低浓度下产生了耐药性。

表3 烟草黑胫病菌游动孢子囊形成对烯酰吗啉的敏感性（贵州，2011年）Table 3 Sensitivity of zoosporangia formation of P.nicotianae var.nicotianae to dimethomorph（Guizhou，2011）

图3 烟草黑胫病菌47个菌株游动孢子囊形成对烯酰吗啉敏感性的频率分布Fig.3 Sensitivity frequency distribution of zoosporangia formation of 47 P.nicotianae var.nicotianae isolates to dimethomorph

3 结论与讨论

试验结果表明：绝大部分菌株为烯酰吗啉一般耐药型，表明贵州烟草黑胫病菌对烯酰吗啉已产生了不同程度的耐药性，推测有2种可能：一种是该地区烟田间存在天然的耐药性菌株；另一种是由于烟农单一使用烯酰吗啉，导致病原菌产生适应性变异而出现了耐药性群体。烯酰吗啉作为生产上单一使用防治烟草黑胫病的药剂具有一定的风险性，建议采用新型杀菌剂，同时开展其他杀菌剂的敏感性试验，为减少病菌抗药性的产生提供理论依据。

对来自贵州省主要烟区47个菌株抗性的差异显著性检验结果及菌株的抗性系统聚类分析结果均表明，不同地区的烟草黑胫病菌对烯酰吗啉敏感性存在显著差异。

烟草黑胫病发病初期病部在高湿条件下可形成大量游动孢子囊并释放游动孢子，所以在田间易形成发病中心。游动孢子囊和游动孢子都可成为再侵染源侵染健康烟株。试验结果表明，烯酰吗啉对黑胫病菌菌丝生长的抑制效果与对游动孢子囊的抑制效果基本相同或略好，当烯酰吗啉的浓度达到8.0μg／mL时可以完全控制烟草黑胫病菌孢子囊的形成。因此，发病初期，在田间使用8.0μg／m L以上浓度的烯酰吗啉可及时对游动孢子囊及游动孢子的萌发起抑制作用，进而有效地抑制病原菌的再侵染，并对病害的传播和流行起到较好的控制作用。

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