HPLC－ESI－MS／MS鉴定夏枯草的主要化学成分

梁杰康 张 琳 严晓明

（1 广东省食品药品监督管理局审评认证中心，广东510080；2 广东省妇幼保健院，广州511400；3 韶关市食品药品检验所，韶关512026）

夏枯草是唇形科夏枯草属植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，有时也以全草入药，因 “此草夏至后即枯”故名，始载于 《神农本草经》，列为下品，其味 “苦辛寒，治寒热瘰疬，鼠瘘头痛，破症，散瘿结气，脚肿湿痹，轻身，一名乃东，生川谷”，为中医临床常用的一味中药［1－2］。夏枯草具有清肝、明目、散结、消肿、止痛之功效，可用于目赤肿痛、目珠夜痛、羞明流泪、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛［3］，临床多用于治疗甲状腺肿大、淋巴结核、乳腺增生、高血压、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎等疾病［4］。研究表明、咖啡酸、迷迭香酸、芦丁、槲皮素等为夏枯草药材中的重要活性成分［5－7］，具有多种药理活性［8］。夏枯草是广东凉茶常用药材，主要以水煎煮或浸泡的方式服用，研究其水提液的活性成分具有重要的意义，然而，相关研究尚无报道。本文通过高效液相色谱电喷雾串联质谱法 （HPLC－EIS－MS／MS）分析鉴定夏枯草水提液的主要化学成分，HPLC－EIS－MS／MS为近年来快速发展的现代分析技术，具有灵敏度高、选择性好等优点，能够提供丰富的化合物结构信息，在中药活性成分鉴定方面具有很大的优势。

1 仪器与试剂

Agilent 1200－6410B高效液相色谱串联四极杆质谱联用仪；Agilent Zorbax SB－C18高效液相色谱柱 （150×2.1mm，3.5μm）；乙腈为色谱纯，水为去离子水，其它试剂为分析纯；对照品葡糖糖酸和柠檬酸购自美国Sigma公司，原儿茶酸、咖啡酸和迷迭香酸购自中国药品生物制品检定所；夏枯草药材购自广州大参林连锁药店，经鉴定为夏枯草 （Prunella vulgaris L.）。

2 实验部分

2.1 样品提取 称取夏枯草5g，置圆底烧瓶中，加入100mL蒸馏水，加热煮沸后提取1h，提取液冷却后转移至100mL的容量瓶中，蒸馏水定容，过0.45μm滤膜，待分析。

2.2 色谱及质谱条件 色谱条件：Zorbax SB－C18高效液相色谱柱 （150mm×2.1mm，3.5μm）；流动相A为0.5%的甲酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱：0～1min，99%A 1%B；1～10min，1%～12%B；10～35min，12%～55%B；后运行5min，99%A 1%B。流速0.3mL／min；进样量5μL。

质谱条件：ESI离子源，负离子检测模式；雾化气和干燥气为N2气，碰撞气为氩气；干燥气温度：350℃，干燥气流速：8L／min；雾化气压力：40psi；裂解电压：175V，毛细管电压：4000V，碰撞能量：0～25V；质谱扫描范围为m／z 50～1000。

3 结果

图1为夏枯草水提液的HPLC－ESI－MS／MS色谱图，谱图中有10个主要的色谱峰，其保留时间、相对峰面积、一级质谱、二级质谱、分子式和推测鉴定的化合物详细信息见表1。

化合物1的 ［M－H］－＝195，对该离子进行二级质谱实验产生m／z＝177、159、129和99的碎片离子，其中m／z＝177和159为失去1个和2个分子H2O所致，该化合物在反相C18柱的保留非常弱，通过与对照品比较保留时间、一级质谱和二级质谱信息，该化合物鉴定为葡糖糖酸。

化合物2的 ［M－H］－＝133，该离子二级质谱实验产生1个m／z＝115的碎片离子，为失去1分子H2O所致，该化合物在反相C18柱的保留也很弱，仅仅比葡糖糖酸稍强，通过与文献比较，该化合物推测为苹果酸。

化合物3的 ［M－H］－＝191，对该离子进行二级质谱实验产生m／z＝173和111的2个碎片离子，其中m／z＝173为失去1分子H2O所致，通过与对照品比较保留时间、一级质谱和二级质谱信息，该化合物鉴定为柠檬酸。

化合物4的 ［M－H］－＝153，对该离子进行二级质谱实验产生1个m／z＝109的碎片离子，为失去1分子CO2所致，通过与对照品比较保留时间、一级质谱和二级质谱信息，该化合物鉴定为原儿茶酸。

化合物5的 ［M－H］－＝197，对其进行二级质谱实验产生m／z＝179、135和73的碎片离子，碎片离子m／z＝179为失去1分子H2O所致，碎片离子m／z＝135为失去1分子H2O和1分子CO2所致，由于缺乏对照品和相关文献报道，该化合物无法得到结构推测和鉴定。

化合物6的 ［M－H］－＝137，该离子二级质谱实验产生1个m／z＝109的碎片离子，为失去1分子CO所致，该化合物在反相C18柱的保留比原儿茶酸稍弱，具有与原儿茶酸相似的裂解规律，通过与文献比较，推测为原儿茶醛。

化合物7的 ［M－H］－＝325，对其进行二级质谱实验产生m／z＝307和187的碎片离子，碎片离子m／z＝307为失去1分子H2O所致，由于缺乏对照品和相关文献报道，该化合物无法得到结构推测和鉴定。

化合物8的 ［M－H］－＝179，该离子二级质谱实验产生1个m／z＝135的碎片离子，为失去1分子H2O所致，通过与对照品比较保留时间、一级质谱和二级质谱信息，该化合物鉴定为咖啡酸。

化合物9的 ［M－H］－＝521，该离子的二级质谱实验产生1个m／z 359的离子碎片，其在反相C柱的保留比迷迭香酸 （化合物10）稍弱，通过与文献比较，该化合物推测为异迷迭香酸苷。

图1 夏枯草水提液的HPLC－ESI－MS色谱图

表1 夏枯草水提液的化学成分鉴定 （%）

化合物10的 ［M－H］－＝359，该离子二级质谱实验产生m／z＝223、197、179、161和133的碎片离子，通过与对照品比较保留时间、一级质谱和二级质谱信息，该化合物鉴定为迷迭香酸。

4 结论

色谱图中的相对峰面积大小代表了其相对应化合物含量的高低，本文的实验结果表明夏枯草水提液中含量最高的三个化合物分别为迷迭香酸 （32.1%）、柠檬酸（14.8%）和咖啡酸 （13.5%），这3个物质均为有机酸类化合物，夏枯草水提液中所含的其它有机酸类化合物还有葡糖 糖 酸 （8.2%）、苹 果 酸 （3.9%）和 原 儿 茶 酸（1.8%），有机酸类化合物的含量占了总含量的74.3%，由此可见，夏枯草水提液的主要活性成分为有机酸类化合物。另外还有一定含量的原儿茶醛 （6.6%）和异迷迭香酸苷 （10.6%）。本文的实验结果为夏枯草的活性成分研究和质量控制标准提供了实验依据。

［1］刘伟，丁海杰，孙曙光.夏枯草HPLC指纹图谱的研究［J］.中草药，2008，39（2）：272－274.

［2］刘伟，丁海杰.HPLC测定夏枯草中熊果酸、齐墩果酸、迷迭香酸的含量［J］.中成药，2008，30（4）：577－579.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2005：197.

［4］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海.上海科技出版社，1977：1827.

［5］刘光敏，贾晓斌，陈彦，等.HPLC法比较不同产地夏枯草属药材中成分组成的差异性［J］.中草药，2010，41（8）：1384－1386.

［6］封亮，贾晓斌，陈彦，等.夏枯草化学成分及抗肿瘤机制研究进展［J］.中华中医药杂志，2008，23（5）：428－433.

［7］贾晓斌，封亮，陈彦，等.夏枯草肺癌化学预防物质基础研究思路与方法［J］.中草药，2009，40（2）：316－318.

［8］刘光敏，贾晓斌，王恒斌，等.夏枯草防治肿瘤化学成分／组分及作用机制研究进展［J］.中药材，2009，32（12）：114－120.