固相萃取/超高效液相色谱－电喷雾串联质谱法检测酶制剂中3-硝基丙酸

张 璐，乐爱山，郑 玲，孔祥虹

(1．陕西出入境检验检疫局，陕西 西安 710068;2．广西出入境检验检疫局，广西 南宁 530022)

酶制剂是果汁加工过程中广泛使用的加工助剂［1－3］，常用的有淀粉酶、果胶酶、蛋白酶、糖化酶、脂肪酶、超滤酶等。果汁生产中使用多种酶制剂以提高加工效率，增加产品稳定性，如使用淀粉酶来转化未成熟果实中的淀粉，使用果胶酶以除去榨汁中的果胶，使用超滤酶增加果汁超滤时的通过率。但用米曲霉发酵产生的酶制剂可能含有强毒物质3-硝基丙酸(3-Nitropropionic acid，3-NPA)。3-硝基丙酸是一种无色针状晶体，为高等植物受霉菌污染产生的有毒物质，可引起牲畜中毒，其中毒症状主要表现为中枢神经系统的损害［4－7］，急性期表现有呕吐、眩晕、阵发性抽搐、昏迷等，严重可导致死亡。联合围粮农组织和世界卫生组织关于食品添加剂的联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives)在1987即明确规定用米曲霉发酵生产的淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖化酶、脂肪酶等时均要检测3-NPA。

目前对于3-NPA的检测主要集中在甘蔗及甘蔗制品［8－9］，且检测方法多为高效液相色谱法［10］、气相色谱法［11］、薄层色谱法［8］等。但这些方法均存在样品前处理繁琐、需使用大量毒性大的有机试剂、干扰较大或需要进行衍生等问题。本文通过对提取、净化、测定及确证等条件的研究及优化，建立了检测酶制剂中3-NPA的固相萃取/超高效液相色谱电喷雾串联质谱方法，可实现对3-NPA的定性及定量分析。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters ACQULTY UPLC－Quattro Premier XE液相色谱－质谱联用仪(美国Waters公司);冷冻离心机(美国Beckman公司);漩涡混合仪(德国IKA公司);LABOROTA4001旋转浓缩仪(德国Heidolph公司);Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

3-NPA(97.5%，Dr.Ehrenstorfer公司);乙腈(色谱纯，Fisher公司);氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯，无水硫酸钠使用前于600℃马弗炉中烘烤5 h后密封保存。PSA固相萃取柱(3 mL，500 mg，Supelco公司)。

3-NPA标准储备液的配制:称取标准品10.0 mg于10 mL棕色容量瓶，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的标准储备液，于－20℃下保存。3-NPA标准工作溶液的配制:取上述储备液0.025 mL于棕色容量瓶中，用甲醇定容至25 mL，配制成1.0 mg/L的标准工作溶液。

1.2 样品前处理

1.2.1 液体酶制剂中3-NPA的提取 称取5.00 g酶制剂样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈振荡20 min后，再加入5 g氯化钠混合均匀后振荡10 min，以4 500 r/min离心5 min。取上清液10 mL，待净化。

1.2.2 固体酶制剂中3-NPA的提取 称取5.00 g酶制剂样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈振荡20 min后，以4 500 r/min离心5 min。取上清液10 mL，待净化。

1.2.3 净 化 PSA固相萃取柱上加1.0 g无水硫酸钠后用6 mL乙腈活化，将试样溶液过柱，用10 mL甲醇洗脱，收集洗脱液。经氮气吹至近干后，用0.5% 甲酸水溶液定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜后，待测。

1.3 仪器条件

色谱条件:色谱柱Waters HSS T3柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)。流动相为乙腈(A)和水(B)，梯度洗脱程序:0～0.5 min，3% ～10%A;0.5～2.0 min，10% ～80%A;2.0～2.8 min，80%A;2.8～3.5 min，80% ～3%A;3.5～4.5 min，3%A。流速0.3 mL/min，进样体积5.0 μL，柱温40℃。

MS/MS条件:离子源为电喷雾电离源，负离子模式(ESI－)，毛细管电压为2.91 kV;离子源温度115℃;脱溶剂气温度:450℃;脱溶剂气流量500 L/h;碰撞气为氩气，流量为0.2 mL/min;锥孔电压13 V;碰撞能量10 eV;检测模式为多反应监测(MRM);母离子为m/z117.9;特征离子为m/z46.3。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯等不同有机溶剂的提取效果。结果表明，甲醇的提取率为90%但干扰较大，乙酸乙酯的提取率仅为70%，而乙腈的提取率达到95%且干扰较少。同时在提取过程中加入氯化钠将水相和有机相分离。适量的氯化钠在离心后加入有助于减少有机溶剂中的漂浮物，使样品更清澈，有利于固相萃取的进行。

2.2 固相萃取柱的选择

据文献报道［12］，可采用乙酸乙酯和三氯甲烷液液萃取的方式提取净化甘蔗中的3-NPA。但该方法的溶剂使用量大，且多次萃取容易造成待测物损失。本研究中采用固相萃取技术完成目标化合物的富集及净化。实验考察了不同萃取柱(Oasis WAX、PSA及氨基柱)的净化效果，结果显示，对酸性物质有较好选择性的Oasis MAX柱［13］虽能将目标物完全保留在小柱上，但无合适的洗脱液将目标物洗脱下来。

实验中比较了特征相似的氨基柱和PSA柱的净化效果。使用加标的乙腈溶液上固相萃取柱后，收集上柱溶液进行分析，3-NPA完全保留在氨基柱和PSA柱上。研究表明当强极性化合物在氨基柱上吸附力太强时可考虑用PSA柱代替［14］。比较了3-NPA的乙腈溶液在氨基柱和PSA柱上的解吸能力，在实验中用不同的洗脱液分别洗脱吸附在两种固相萃取柱上的3-NPA(见图1)。实验结果表明，过PSA固相萃取柱的回收率高于氨基柱，可能是由于目标化合物3-NPA在氨基柱上吸附过强。因此实验选择PSA柱为固相萃取柱进行进化。

图1 3-NPA在不同固相萃取柱上的解离图Fig.1 Figure of dissociation of 3-NPA in different solid phase extraction columns

2.3 PSA固相萃取条件的优化

为了提高净化效果和降低基质效应，一般会对固相萃取柱进行淋洗。实验考察了不同体积比(10∶90、12∶88、20∶80)的异丙醇－乙腈作为淋洗液时3-NPA的损失情况。结果表明，用上述淋洗液后3-NPA均有损失。因此实验不采用淋洗步骤，而通过基质标准曲线降低基质效应的影响。

吸附于PSA固相萃取柱上的目标化合物，需要强极性溶剂进行洗脱。实验考察了乙腈、甲醇以及不同体积比的乙腈－甲醇(50∶50、30∶70、10∶90)溶液的洗脱能力，实验结果表明，甲醇比例越高，吸附在PSA柱上的3-NPA越容易洗脱下来。最终选择100%甲醇作为洗脱溶液。进一步考察了甲醇用量(3、5、8、10、15、20 mL)的影响，结果显示当洗脱溶液体积达到10 mL时，3-NPA已被全部洗脱下来，最终确定10 mL甲醇为洗脱溶液。

2.4 色谱柱的选择

文献报道使用反相色谱柱分离3-NPA时，由于3-NPA具有很强的酸性和亲水性，在反相柱上保留较弱，因此需要使用磷酸二氢钾溶液作为流动相［15］。由于液质联用不建议用磷酸盐等不挥发性物质为流动相，因此实验重点考察了有利于极性物质保留的反相色谱柱Waters ACQUITY HSS T3、Waters ACQUITY C18、Aglient Eclipse Plus C18、Waters UPLC BEH Amide及亲水性色谱柱Waters ACQUITY BEH HILIC对3-NPA的分离效果(见图2)。结果表明，3-NPA在Waters ACQUITY C18及Aglient Eclipse Plus C18的保留时间均在0.7 min，且峰形拖尾，在Waters ACQUITY BEH HILIC及Waters UPLC BEH Amide上的峰形尽管有所改善但仍有拖尾。而3-NPA在Waters ACQUITY HSS T3上的保留时间在1.5 min，且峰形良好。因此选择Waters ACQUITY HSS T3作为3-NPA的分析柱。

图2 3-NPA在不同色谱柱上的保留色谱图Fig.2 Chromatograms of retention of 3-NPA on different columns A．Waters ACQUITY C18(1.8 μm，2.1 mm ×100 mm);B．Aglient Eclipse Plus C18(1.8 μm，2.1 mm ×100 mm);C．ACQUITY BEH HILIC(1.8 μm，2.1 mm ×100 mm);D．Waters UPLC BEH Amide(1.7 μm，2.1 mm ×100 mm);E．Waters ACQUITY HSS T3(1.8 μm，2.1 mm ×100 mm)

2.5 流动相条件的优化

由于3-NPA是一种小分子有机酸，具有较强的酸性和亲水性。因此主要考察了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－5 mmol/L乙酸铵溶液体系的分离效果。结果表明，乙腈－水为流动相时的响应最高，且保留时间在1.5 min以后。流动相中加盐后灵敏度降低，可能是盐的存在抑制了目标化合物的电离。因此确定乙腈－水为最佳流动相。

为了增强目标化合物在色谱柱上的保留。实验比较了纯水、0.1%氨水溶液、0.05%甲酸水溶液、0.5%甲酸水溶液、5 mmol/L甲酸铵溶液作为定容液时对目标化合物响应的影响。实验发现，用0.5%甲酸水溶液作为定容溶液时不仅保留时间明显增强，且响应也明显增强。最终确定0.5%甲酸水溶液作为定容溶液。

2.6 基质干扰的影响

由于酶制剂大多由真菌菌种发酵而成，含有大量蛋白，因此对3-NPA的提取及测定有干扰，且无法得到3-NPA的同位素内标。因此选择基质加标工作曲线进行外标法定量，对基质效应及净化过程中的损失进行校正。以果胶酶为例，不采用果胶酶基质标准时，加标5.0 μg/kg的回收率为32.1%～42.1%，而采用基质标准后，回收率为63.2%～79.6%。回收率提高了1倍。实验还比较了不同酶制剂为基质标准对3-NPA检测的干扰校正情况(见图3)，不同酶制剂对3-NPA的干扰影响不同，果胶酶对3-NPA的抑制干扰最大，果胶超滤酶的干扰较小，因此实验需要对不同品种的酶制剂进行基质标准校正，进而进行定量分析。

图3 不同酶制剂的基质影响效应Fig.3 The matrix effects of different zymins

2.7 方法验证参数

对不同种类的酶制剂绘制基质标准曲线。分别称取6份5.0 g空白酶制剂基质于50 mL离心管中，分别加入1.0 μg/L标准工作溶液25、50、100、150、250 μL，进行前处理后在优化条件下测定。以3-NPA的峰面积(Y)对相应的质量浓度(X，μg/L)绘制基质标准工作曲线。得出回归方程、相关系数、线性范围及定量下限(S/N≥10)(见表1)。结果显示，3-硝基丙酸在6种酶制剂基质中的线性范围均为12.5 ～125 μg·L－1，相关系数大于 0.993，定量下限为 5.0 μg/kg。

表1 不同酶制剂的回归方程、相关系数(r)、线性范围及定量下限Table 1 Regression equation，correlation coefficient(r)，linearity range and detection limit in different zymin

分别称取不含3-NPA的空白果胶酶、果胶超滤酶、诺维信复合果胶酶、蛋白酶、蔗糖酶样品进行方法回收率和精密度试验。加入的3-NPA标准品浓度分别为5.0、10.0、20.0 μg/kg，每种浓度做5次平行，按优化方法进行实验。每种样品的平均回收率及相对标准偏差(RSD)见表2。在3个加标水平下，3-硝基丙酸的回收率为69.1%～114.4%，RSD为6.9%～8.9%。

表2 3-NPA在不同种类酶制剂的加标回收率及相对标准偏差Table 2 Recovery and precision of 3-NPA in different enzymic preparations

2.8 方法应用

为了考察本方法的有效性与实用性，采购7种常用的酶制剂样品进行3-NPA的检测。结果表明，所有样品中均未检出3-NPA残留。图4为酶制剂实际样品的色谱图。

图4 果胶酶样品(A)及样品加标(B)的色谱图Fig.4 Chromatograms of pectinase sample(A)and sample spiked with 3-NPA(B)

3 结论

本文建立了酶制剂中3-NPA的超高效液相色谱－电喷雾串联质谱检测方法。样品经乙腈提取，固相萃取柱净化，质谱确认后，可实现对3-NPA的定性及定量分析。该方法前处理过程简便、灵敏度高、选择性好，可满足日常检测的需要，为酶制剂的质量安全提供了技术保障。

［1］ Leza H A R，Jasso R M R，Esquivel J C C，Herrera R R，Aguilar C N．Biohem.Eng.J，2012，65:90－95．

［2］ Carrín M E，Ceci L N，Lozano J E．Food Chem．，2004，84:173 －178．

［3］ Tribst A A L，Cristianini M．Innovative Food Science and Emerging Technologies，2012，13:107 －111．

［4］ Li F，Xu Q Y．Lab.Animal Sci．(李峰，徐群渊．实验动物科学)，2009，26(4):12－15．

［5］ Liu H G，Ma Y，Yang A C，Meng D W，Zhang Y，Zhang J G．Chinese Journal of Minimally Invasive Neurosurgery(刘焕光，马羽，杨岸超，孟大伟，张颖，张建国．中国微侵袭神经外科杂志)，2012，17(7):319－321．

［6］ Olsen C，Rustad A，Fonnum F，Paulsen R E，Hassel B．Brain Res．，1999，850:144 －149．

［7］ Luchowski P，Luchowska E，Turskia W A，Urbanskaa E M．Neurosci．Lett．，2002，330:49 －52．

［8］ Liu Y，Wang Y H，Liu X J，Li X F，Liu Z H，Hu W J．J.Hyg.Res．(刘勇，王玉华，刘兴玠，李秀芳，刘增辉，胡文娟．卫生研究)，1989，18(5):38－40．

［9］ Shao G J，Han J K，Wu D Q．Chin.J.Health Lab.Technol．(邵国健，韩建康，吴丹青．中国卫生检验杂志)，2012，22(4):711－712．

［10］ Jiang T，Zhang Q L，Luo X Y．J.Hyg.Res．(江涛，张庆林，罗雪云．卫生研究)，1999，28(5):300－302．

［11］ Wang J，Lei Z Y，Feng X Q．Pratacultural Science(汪儆，雷祖玉，冯学勤．草业科学)，1992，9(2):34－37．

［12］ WS/T 10 －1996．Diagnotic Criteria and Principles of Management for Food Poisoning of Mildew Sugareane．Standards of Ministry of Health of the Peoples Republic of China(变质甘蔗食物中毒诊断标准及处理原则．中华人民共和国卫生部标准)．

［13］ Li B，Wu G H，Liu W，Zhao X D，Zhao H Y，Xue Y，Zhao R．Chin.J.Food Hyg．(李兵，吴国华，刘伟，赵旭东，赵海燕，薜颖，赵榕．中国食品卫生杂志)，2012，24(2):127－132．

［14］ Chen X H，Wang Q J．Technology and Application of Solid-phase Extraction．Beijing:Science Press(陈小华，汪群杰．固相萃取技术与应用．北京:科学出版社)，2010:56．

［15］ Gong X M，Ren Y P，Dong J，Sun J，Li J，Jin C，Yu J L．J.Instrum.Anal．(宫小明，任一平，董静，孙军，李健，金超，于金玲．分析测试学报)，2011，30(1):6－12．