拟南芥HSP70基因启动子表达载体的构建及在烟草BY2细胞中的应用

郑 帮，陈 燕，褚艳霞，孙虎林，郑亚洁，孙恒吉，司英语，周树敏，张 卫

(上海大学 生命科学学院，上海200444)

0 引言

热激蛋白HSP70是拟南芥HSP70基因家族中的一种，其表达会随着温度的升高而增强，即热激特性［1］．这种热激特性是由热激蛋白HSP70的启动子决定的，因此拟南芥的HSP70基因启动子也成为研究的热点之一．在以拟南芥植株为实验材料，将含有拟南芥的HSP70基因启动子的表达载体转入其中进行表达．受到植株生长周期长的影响，会造成实验周期长，对实验进展造成一定的影响．烟草BY2细胞(Nicotiana tabacum L．cv Bright Yellow2，BY2)是非常重要而且用途广泛的细胞系［2－3］，由 Kato 等于1972年分离得到［4］．BY2细胞可以比较容易地转化外源基因，此外，BY2细胞系拥有高度的同一性，且生长迅速，可获得具高度同周期性的BY2细胞，1周内便可增加80～100倍．因此，BY2细胞已成为研究生物研究的模式系统［5］，而且转基因BY2细胞团和悬浮培养细胞都较容易获得．因此若能将含有拟南芥的HSP70基因启动子且以GFP为报告基因的表达载体转入其中，且可正常表达报告基因，则可明显缩短实验周期，对热激蛋白HSP70启动子的后续实验研究提供大量丰富的实验材料．

1 材料

1．1 植物材料

本实验室自有拟南芥Columbia生态型(Arabidopsis thaliana)，置于温度为22℃，光照为16 h光照，8 h黑暗的人工光照温室培养［6］．实验室自有液体悬浮烟草 BY2细胞，27℃，130 r/min，暗培养［7］．培养基配方见参考文献

1．2 引物和试剂

在www．arabidopsis．org网站下载HSP70启动子的序列并依据启动子的序列设计引物，在上下游引物两端分别加入HindⅢ和Sac1酶切位点．长度选取转录起始点至上游1．5 kbp．实验所用引物如表1所示．

实验室自有GFP－T质粒．GFP基因序列已经测序验证且正确．

表1 实验所用引物

引物合成由上海生工生物工程公司进行合成．

PCR扩增采用takara公司生产的KOD PCR扩增试剂盒．PCR扩增参数为:

胶回收试剂盒由takara公司生产的胶回收试剂盒进行胶回收．

pMD18－T载体和连接酶Solution I由TAKARA公司生产．连接体系(10μL)如下所示:

2 方法

2．1 基因组抽提

采用试剂盒抽提基因组的方法．试剂盒购自康为世纪生物技术公司．

2．2 表达载体的构建流程

2．3 转化入农杆菌

将构建好的表达载体采用热激转化的方法转入农杆菌GV3101，并对农杆菌菌落进行阳性克隆的筛选和鉴定．转化方法详见参考文献［8－9］．

2．4 转基因

(1)将鉴定已经转入表达载体的农杆菌GV3101阳性克隆划板，且挑取单克隆进行小型摇培(5 mL)，继而进行转基因操作．具体转化步骤:

(2)从农杆菌平板上挑取单菌落于2 mL LB培养基，250 r/min，28℃过夜，OD600至0．6．

(3)洗农杆菌:1 mL菌液:2500 g离心10 min，室温，去上清，加入1 mL 10 mmol/L MgSO4，混匀，2500 g离心10 min，去上清，加入1 mL 10 mmol/L MgSO4，混匀，加入2μL 200 mmol/L As(有利于转化，也可不加)，室温静置2 h．

(4)分装悬浮培养的烟草BY2细胞5 mL于小培养皿中(一般1个基因做2个，1个空白对照)，用移液器吹打20次，诱导缺口，有利于转化．

(5)加入100μL处理好的农杆菌，轻轻摇匀，对照加入100 lL ddH2O．

(6)28℃静置暗培养48 h．

(7)每个培养皿中加入5 mL BY2液体培养基轻轻摇匀．

(8)转入50 mL EP管，用BY2液体培养基补到总体积25 mL．

(9)1000 g离心5 min，室温．

(10)小心倒去上清，均匀倒在含有潮霉素的BY2固体培养基平板．

(11)28℃静置培养3周．

2．5 阳性克隆细胞团的筛选

转基因BY2细胞转化后约3周可在50μg/mL的潮霉素和万古霉素抗性平板上长出阳性单克隆的细胞团，潮霉素起到筛选阳性克隆的作用，万古霉素起抑制农杆菌的生长，并将所筛选到的阳性单克隆细胞团移出至新的50μg/mL的潮霉素抗性平板传接一代，再接至液体培养基培养传代，如图1所示:

图1 转化后的BY2细胞传代

3 结果

3．1 HSP70启动子克隆

从拟南芥基因组中PCR扩增HSP70启动子(图2)和HSP70启动子与T－载体连接后的酶切(图3)鉴定电泳图．

图2 PCR扩增HSP70启动子

图3 HSP70启动子与T－载体连接后酶切鉴定

将HSP70启动子测序结果与NCBI网站的原始序列进行比对，测序结果和原始序列完全匹配，无缺失、错配等．

HSP70启动子序列如图4所示．

图4 HSP70启动子序列

3．2 表达载体的鉴定

将构建好的表达载体阳性克隆抽提质粒并进行酶切鉴定．对HSP70启动子采用HindⅢ和Sac I进行双酶切鉴定(图5)，对GFP采用BamH I和Sal I进行双酶切鉴定(图6)，并用HindⅢ和Sal I进行双酶切切出HSP70启动子加GFP片段(图7)，分别切出1．5 kb条带，750 bp条带，2．25 kb条带以及剩余的载体条带．酶切鉴定结果如图7．

3．3 转基因BY2细胞鉴定

对筛选到的阳性细胞团基因组进行PCR鉴定，PCR扩增条带包括GFP及HSP70启动子部分片段，长度约为550bp，抗性平板共筛选到11个阳性细胞团，PCR鉴定结果如图8．

图5 HSP70启动子酶切鉴定

图6 GFP酶切鉴定

图7 HSP70启动子和GFP酶切鉴定

图8 转基因细胞PCR鉴定

3．4 荧光观察

通过采用激光共聚焦荧光显微镜对转基因和非转基因即野生型(WT)BY2细胞的荧光观察发现，野生型即非转基因BY2细胞有极其微弱的自发荧光，几乎看不到，但转基因BY2细胞的荧光要远远强于野生型BY2细胞(图9)．同时对野生型和荧光强度进行定量(图10)．RT－PCR结果证明野生型BY2细胞中并无GFP的表达，而转基因BY2细胞中表达很强(图11)．

图9 BY2细胞荧光观察

图10 荧光定量结果

图11 RT－PCR结果

4 讨论

拟南芥的HSP70基因启动子是一种热激起动子，对其的研究一直是现代生物学的热点，其表达的强弱受到受到多方面因素的影响，如外界温度，自身启动子的顺式元件以及反式元件的协同作用［1］．随着现代分子生物学的发展，实验操作的很多环节均可采用试剂盒来快速完成实验的操作，大大节省了时间，但是植物种植的时间很难缩短，因此在实验材料的获得上往往会限制实验的进展速度，具体以拟南芥为例，其生育周期常为42～56 d，在生长到20 d左右时可以转化，收到种子干燥10 d后才可筛选阳性苗，在筛选阳性苗的过程中还要经过春化，发苗等过程，在阳性苗生长到可以取材进行时，后续实验还要生长一段时间［10］，且植株生长周期有限，有幼苗期和衰老时期不可能随时进行取材，但是液体悬浮培养的BY2细胞生命周期短，转接传代操作简单，可随时取材进行观察，省去植物种植的时间，因此将拟南芥的HSP70基因启动子表达GFP的表达载体转入液体悬浮培养的BY2细胞，可在一次转化后大量传接培养，4～7 d便可传代培养一次，相比于种植一代植物可节省大量时间，可明显缩短后续实验的周期，且由于液体悬浮培养的BY2细胞繁殖快，可大量传接，因此可以获得大量的实验材料，从而利于对拟南芥的HSP70基因启动子的研究，并对其他基因的研究提供可借鉴的思路．

［1］CATHERINE H U，SIOUYING L，WEN T，et al．Recent gene duplication and subfunctionalization produced a mitochondrial grpE，the nucleotide exchange factor of the Hsp70 complex，specialized in thermotolerance to chronic heat stress in arabidopsis［J］．Plant Physiology，2012，158:747 － 758．

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