左归丸对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠IL-23/IL-17炎性轴的影响

张晓晶，钟相根，贾 旭，邓秀兰，王青青，郑子安，王 坦

(北京中医药大学基础医学院，北京 100029)

左归丸对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠IL-23/IL-17炎性轴的影响

张晓晶，钟相根*，贾 旭，邓秀兰，王青青，郑子安，王 坦

(北京中医药大学基础医学院，北京 100029)

目的：探讨左归丸对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠(experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE)IL-23/IL-17炎性轴的影响。方法：建立髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(myelinoligodendrocyteglycoprotein35-55,MOG35-55)诱导C57BL/6小鼠EAE模型，随机分为模型组、泼尼松组、左归丸组，并设正常对照组。观察小鼠的发病情况、神经功能评分及体质量变化，HE染色观察CNS病理损伤程度,实时荧光定量PCR法检测小鼠脑组织IL-23p19、IL-17mRNA表达。结果：与正常对照组比较，模型组脑组织IL-23p19、IL-17mRNA表达显著升高。左归丸及泼尼松组小鼠脑组织IL-23p19、IL-17mRNA表达比模型组低(P<0.05，P<0.01)。结论：左归丸能够抑制IL-23/IL-17炎性轴而起到抗炎作用。

多发性硬化；实验性自身免疫性脑脊髓炎；左归丸；IL-23/IL-17炎性轴；小鼠

多发性硬化症(multiplesclerosis，MS)是一种缓慢进展的中枢神经系统自身免疫性炎性脱髓鞘疾病[1]，其发病机制尚未阐明。新近研究表明，IL-23/IL-17炎性轴在多发性硬化症发病中起关键作用[2]。目前，西医尚无特效疗法,临床上治疗多发性硬化症的药物包括糖皮质激素、β-干扰素、环孢霉素A等。这些药物虽可明显改善多发性硬化症患者急性期的临床症状，但尚无循证医学的证据表明其可有效控制疾病复发及减缓疾病进展，而且由于不良反应限制了它们的临床应用，不宜作为长期维持治疗用药。

近年来，我国学者研究表明[3-4]，左归丸可有效治疗大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。本研究观察左归丸对EAE小鼠脑组织IL-23p19、IL-17mRNA的影响，探讨左归丸能否通过抑制IL-23/IL-17炎性轴，进而治疗EAE。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级C57BL/6小鼠，雌性，40只，6～8周龄，体质量18～20g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2007-0001]，饲养于北京中医药大学实验动物中心。

1.2 试剂及仪器MOG35-55，纯度>97.25%，肽序列为MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(生工生物工程(上海)有限公司)。完全弗氏佐剂(CompleteFreud’sAdjuvant，CFA)购于sigma。百日咳毒素(Pertussistoxin)来源于Bordetellapertusssis。人结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，H37Ra)(Difcocompany，USA)。TRIpureReagent(北京艾德莱生物科技有限公司)。M-MuLV(反转录酶 200U/μL)购于Fermentas(MBI)公司。RNaseInhibitor购于Fermentas(MBI)公司。Miniopticon实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司)。

1.3 实验分组及处理 将EAE小鼠随机分为：模型组、泼尼松组、左归丸组，另设正常对照组，共4组。免疫后，按组别分别做如下处理：模型组每天给与生理盐水灌胃；泼尼松组每天给与生理盐水灌胃，发病后改为醋酸泼尼松混悬液(7mg/kg，用生理盐水配制成要求的浓度)；左归丸组每天给与左归丸(2.8g/kg，用生理盐水配制成要求的浓度)混悬液灌胃。正常对照组，相同条件和环境中饲养，不作任何处理。

每组实验小鼠在造模后于免疫后第30天取材。取脑组织按realtime-PCR方法要求处理样品待测；HE染色观察取材用10%水合氯醛经腹腔注射麻醉小鼠，剪开胸部，将灌注针由左心室穿入主动脉，依次注入0.9%生理盐水、4%多聚甲醛。经心灌注30min后，完整取出脑组织固定于0.1kg/L福尔马林磷酸缓冲液中24h，石蜡包埋以备切片。取出石蜡块连续切片，5μm切片行HE染色。

1.4 小鼠EAE模型建立 按照课题组建立的方法[5]构建EAE小鼠模型。具体实验步骤如下：将MOG35-55(4mg/mL，用灭菌后PBS配制相应浓度)与等体积的CFA(含4mg/mL的H37Ra)用已经灭菌玻璃注射器充分乳化。用乙醚麻醉C57BL/6小鼠，分三点给小鼠背部皮下注射(100μL/只)乳化液。背部两肩正中、后背部中线两侧各33.3μL。最终每只小鼠皮下注射的MOG35-55和H37Ra均为200μg。在免疫当天给每只小鼠腹腔注射400ngPTX。在免疫72h后给每只小鼠再次腹腔注射400ngPTX。

1.5 小鼠神经功能评分 从初次免疫第0天起至第30天实验终止前，采用盲法，每天2人至少一次在同一时间按Benson评分标准对EAE严重性进行临床评估。0分，没有明显疾病症状；1分，尾巴张力消失或者后肢无力；2分，尾巴张力消失和后肢无力；3分，后肢部分瘫痪；4分，后肢完全瘫痪；5分，濒死状态或者死亡。

1.6 实时荧光定量PCR(realtime-PCR)检测脑组织IL-23p19、IL-17mRNA表达 取脑组织约100mg，常规TRIzol提取总RNA，经260nm和280nm测定其吸光度比值在1.8～2.0为纯度合格。用RT-PCR试剂盒合成cDNA,再以合成的cDNA为模板进行PCR扩增(操作方式按照试剂盒说明)，引物序列见表1所示。PCR反应条件如下:GAPDH和IL-23的反应程序为：95 ℃ 5min预变性后，95 ℃ 30s→65 ℃ 30s(荧光检测)，41个循环。IL-17的反应程序为：95 ℃ 5min预变性后，95 ℃ 20s→68 ℃30s→72 ℃ 30s(荧光检测)，41个循环。同时做溶解曲线来确认是否为单一峰。反应结束后，以琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物是否符合原设计片段长度。

结果判定：PCR反应及数据采集于LightCycler2.0系统上进行，记录其循环阈值(CT)，以相对定量公式2-ΔΔCT计算每个样品中靶基因的相对mRNA表达，其中ΔCt值=靶基因Ct值-GAPDHCt值。

表1 PCR引物序列

2 结果

2.1EAE小鼠发病率、神经功能评分及体质量变化 免疫诱导后15d开始，小鼠逐渐发病，表现为活动减少、体质量减轻、尾部及四肢无力，符合EAE小鼠模型表现。左归丸及泼尼松干预后发病率降低、神经功能评分及体质量减轻均明显改善。各组小鼠发病率、神经功能评分、体质量变化分别见下图1、图2、图3。

图1 各组小鼠发病率比较

图2 各组小鼠神经功能评分比较

图3 各组小鼠体质量变化比较

2.2EAE小鼠脑组织病理改变HE染色观察，正常对照组未见明显的炎症改变。EAE模型组小鼠大脑实质内可见大量炎症细胞浸润，部分微血管周围被炎症细胞围绕，形成典型的“血管袖套样”改变。左归丸及泼尼松组脑组织炎性细胞浸润明显改善。

表2 各组脑组织IL23 p19、IL-17 mRNA表达比较(n=6)

注：vscontrolgroup，#P<0.05，##P<0.01；vsEAEgroup，*P<0.05，**P<0.01。

2.3IL-23p19、IL-17mRNA的表达 如表2所示，模型组IL-23p19、IL-17mRNA比正常组表达增加(P<0.01)。与模型组比较，左归丸及泼尼松组表达均显著降低(P<0.05，P<0.01)。

3 讨论

实验性变态反应性脑脊髓炎与人类多发性硬化(MS)的病理变化极其相似，是研究MS的经典动物模型。长期以来，EAE/MS被认为是以IL-12诱导的Thl细胞反应为主的自身免疫性疾病。然而，一系列的矛盾困扰着人们。如IL-12是Thl分化的关键因子，IL-12基因敲除小鼠仍能产生EAE[6]。IFN-γ是Thl的重要致病因子，然而IFN-γ基因敲除小鼠仍能诱导产生EAE，而且恢复缓慢。Thl7细胞的发现和IL-23功能的研究，解释了以上的困惑。

Th17细胞是新近发现的一类CD4+细胞亚群，因其独特的表型特征和分泌IL-17而得名，是和Th1细胞亚群、Th2细胞亚群相对应的一组细胞亚群[7-8]。Th17细胞亚群具有高度的致病性，Th17细胞和IL-17在EAE的发生发展中起关键性作用[9]。Th17细胞通过分泌一系列的促炎因子如IL-17、IL-17F、TNF-α、IL-6而发挥作用。IL-17作为IL-17家族的代表性因子，可以发现在EAE中表达升高；IL-17基因敲除小鼠对EAE不敏感；抗IL-17抗体可以使EAE症状明显减轻[10]。

IL-23是新近发现IL-12家族细胞因子。IL-23由p19和p40两个亚基组成，而IL-12由p35和p40亚基组成，两者有共同亚基p40。IL-12p35亚基敲除小鼠仍能诱导产生EAE，而出人意料的是，当IL-12p40亚基敲除和IL-23p19亚基敲除小鼠不能诱导产生EAE[11]。使用IL-23p19亚基抗体处理EAE，可使小鼠临床症状减轻，IL-17分泌降低[12]。结果证实IL-23而不是以往所认为的IL-12在EAE中发挥核心作用，即IL-23比IL-12更为关键[11]。

但是IL-23不是产生Thl7细胞的必须条件，单独的IL-23不能诱导幼稚性NaiveCD4+细胞向Thl7细胞分化，只能诱导记忆性CD4+细胞向Thl7细胞分化，但IL-23在促进IL-17分泌，维持和增强Th17细胞效应功能方面起着关键性作用[13]，称为IL-23/IL-17轴[4,15]。据此，最近有学者提出了EAE/MS的IL-23/IL-17炎性轴发病机制学说。

既往研究表明，中医药防治MS具有较明显的学科优势[16-17]，如左归丸可有效治疗大鼠EAE。本实验研究显示，左归丸可改善EAE小鼠神经功能评分，抑制EAE小鼠脑组织IL-23p19、IL-17mRNA表达。提示左归丸可通过抑制IL-23/IL-17炎性轴而起到抗炎治疗作用，进而改善EAE神经功能评分。

可见，左归丸能够通过影响IL-23/IL-17炎性免疫发病轴，起到抗炎治疗作用，为左归丸在多发性硬化中的应用提供了新的理论依据。

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R744.5 < class="emphasis_bold">文献标志码A

A

1003-5699(2013)06-0615-03

国家自然科学基金项目(30901909);高等学校博士学科点专项科研基金新教师基金项目(200800261037)。

张晓晶(1968-)，男，实验师。研究方向：

*[通信作者] 钟相根，男，医学博士，教授。Tel：010-64286194，E-mail：zhongxg@bucm.edu.cn。

2013-01-12)