分散固相萃取-气相色谱法测定茶叶中25种有机氯与拟除虫菊酯农药残留

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(1中粮营养健康研究院，北京100020；2.北京市营养健康与食品安全重点实验室，北京100020)

茶叶是我国传统的农产品，其生产面积和总产量均居世界第一[1]。近年来，欧盟、日本等茶叶进口国家对茶叶制定了严苛的农药残留限量标准，农药残留检测项目不断增多，最大残留限量大幅降低，茶叶的质量安全已成为我国茶叶出口的“绿色壁垒”[2]。2013年3月1日，《GB 2763-2012 食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》正式实施，新国标中涉及茶叶的最大农药残留限量品种增加到25种，因此建立茶叶中多种农药同时分析的方法具有重要的现实意义。有机氯农药是人工合成的含氯有机化合物，主要包括以苯为原料和以环戊二烯为原料合成的两类化合物，有机氯农药毒性强、不易分解，我国自1983年起已全面禁用六六六、滴滴涕等有机氯杀虫剂[3]。拟除虫菊酯农药属于仿生性杀虫剂，其化学结构与天然除虫菊素类似[3]。由于其具有高效低毒等特性，在我国茶园中得到广泛应用，造成菊酯类农残现象较为普遍。

文献中已报道的提取与净化方法有微波辅助萃取-固相微萃取[4]、直接悬挂液滴微萃取[5]、搅拌棒吸附萃取[6]、固相萃取[7-10]、QuEChERS[11]、加速溶剂萃取-凝胶渗透色谱[12]、亚临界水萃取[13]，检测方法有气相色谱-电子捕获检测器(GC-ECD)[4-8,10,12]、液相色谱(HPLC)[9]、气相色谱-质谱(GC/MS)[7,12,14]、气相色谱-串联质谱(GC/MS/MS)[13]和液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)[11]。固相萃取提取效率高，但操作繁琐、溶剂用量大且SPE柱成本较高；微波辅助萃取、加速溶剂萃取和凝胶渗透色谱等方法自动化程度高，但仪器投入较大、对操作人员也提出较高要求；质谱灵敏度高、可提供化合物的结构信息，在农残分析研究中已广泛应用，但质谱仪器昂贵、运行及维护成本较高，不适合基层企业日常检验使用。茶叶生产企业在对原料及产品的农药残留量监控过程中，需要对大量的样品进行处理和检测，因此，简单快速的分散固相萃取前处理技术结合高灵敏度低成本的气相色谱方法成为茶叶企业检测有机氯与拟除虫菊酯类农药的首选方法。本研究通过乙腈超声提取，石墨化炭黑(GCB)和乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)分散固相萃取净化，结合GC-ECD检测茶叶中25种有机氯与拟除虫菊酯农药的残留量，建立了一个适合于企业质量控制的农残检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GC-2010Plus气相色谱仪(配ECD检测器，日本岛津公司)，TG 16-II台式高速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)，BSA 224S-CW电子天平(德国赛多利斯集团)，SB-3200 DTDN超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，HGC-24A氮吹仪(天津恒奥科技发展有限公司)，QL-902旋涡混合器(海门其林贝尔仪器制造有限公司)。

农药标准品：α-六六六(α-BHC)、β-六六六(β-BHC)、γ-六六六(γ-BHC)、δ-六六六(δ-BHC)、七氯(Heptachlor)、艾氏剂(Aldrin)、o,p’-滴滴滴(o,p’-DDD)、o,p’-滴滴伊(o,p’-DDE)、o,p’-滴滴涕(o,p’-DDT)、p,p’-滴滴滴(p,p’-DDD)、p,p’-滴滴伊(p,p’-DDE)、p,p’-滴滴涕(p,p’-DDT)、α-硫丹(α-Endosulfan)、β-硫丹(β-Endosulfan)、硫丹硫酸酯(Endosulfan-sulfate)、联苯菊酯(Bifenthrin)、甲氰菊酯(Fenpropathrin)、高效氯氟氰菊酯(Cyfluthrin)、氯菊酯(Permethrin)、λ-氯氰菊酯(Cyhalothrin)、氟氰戊菊酯(Flucythrinate)、高效氰戊菊酯(Esfenvalerate)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、三氯杀螨砜(Tetradifon)、哒螨灵(Pyridaben)(纯度在87.0～99.6%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)。石墨化炭黑(GCB)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(北京BESEP公司)。乙腈、正己烷、石油醚、丙酮、甲苯(色谱纯，美国Fisher公司)。

茶叶样品购自市场。

1.2 实验方法

1.2.1 标准储备液的配制

精确称取25种农药的标准品，用甲苯-丙酮混合溶液配制成1 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃条件下储存。

混合农药标准储备液：根据25种农药在仪器上的响应值分别准确移取各种农药标准品适量，用正己烷配制成混合标准储备液，于-18 ℃冰箱中保存，使用时根据实际需要进行稀释。

1.2.2 样品前处理

粉碎：取茶叶样品100 g，粉碎机粉碎，用圆孔筛筛出≤2.0 mm颗粒。混匀，装入洁净容器内，密封，冷藏保存。提取：将2.50 g(精确至0.01 g)干茶叶粉末，于50 mL离心管中加入10 mL乙腈，超声提取20 min，于3000 r/min离心5 min。净化：取一支10 mL离心管，加入30 mg GCB、40 mg PSA吸附剂，转入上述上清提取液1.5 mL，涡旋混合3 min，于6000 r/min离心3 min，取出上清液0.8 mL，氮吹近干后以正己烷复溶至0.8 mL，过0.22 μm尼龙滤膜，待GC-ECD分析。

1.2.3 仪器条件

色谱柱：DB-35ms毛细管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；恒线速率模式，初始流速1.0 mL/min；进样口：分流进样，分流比10∶1，温度280 °C，进样量1 μL；升温程序：150 °C保持2 min，10 °C /min升至300 °C，保持30 min；载气：N2，纯度≥99.999%；ECD检测器：温度320 °C。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

大部分有机氯和拟除虫菊酯类农药的极性较小，因此色谱柱优化实验选用适合分析非极性与弱极性化合物的Rtx-1、DB-5MS和DB-35MS三种毛细管色谱柱，规格均为30 m×0.25 mm×0.25 μm。

结果表明，Rtx-1对联苯菊酯和甲氰菊酯没有达到有效分离；DB-5MS和DB-35MS对25种农药均有较好的分离能力，由于DB-35MS具有更好的耐高温性能，可在检测时通过设置更高的柱箱温度净化色谱柱，降低基线升高对下一次分析造成的干扰，适用于多次连续进样。因此本实验选择DB-35MS作为色谱柱。

2.2 提取剂的选择

茶叶基质复杂且同时提取25种农药，数量较多，极性也存在一定差异，因此实验选择了乙腈、石油醚、正己烷-丙酮(V∶V=9∶1)三种提取剂进行优化。

研究表明：如图1所示，石油醚对5种农药的加标回收情况不理想，β-六六六和δ-六六六的回收率小于30%；正己烷-丙酮和乙腈对大多数农药有较好的回收率，可以满足实验要求，但丙酮对茶叶中的杂质提取较多，在色谱图上杂质峰干扰严重、基线较差，无法满足分析检测需求；乙腈极性大、穿透性强，适合多农药残留的提取。因此，选择乙腈作为提取剂。

图1 3种提取剂对部分农药回收率的影响

2.3 提取方式的选择

实验考察了摇床摇动、手动振荡+涡旋和超声3种提取方式。

3种提取方式中，摇床摇动需要1小时，提取时间较长，不适合企业的高通量分析；手动振荡3 min+涡旋1 min时间短强度大，但是平行操作的误差较大，回收率不稳定，实验重现性差；超声提取20 min条件下，大部分农药具有较好的回收率，见图2。因此选择超声20 min作为茶叶中有机氯和拟除虫菊酯的提取方式。

2.4 吸附剂用量的选择

实验考察了GCB在5～30 mg和PSA在0～50 mg之间的用量。

GCB对茶叶中大量的色素有很强的去除能力，但同时也对农药产生一定的吸附力，所以GCB的用量不宜太大；PSA有两个氨基，能去除植物基质中的有机酸、金属离子、多酚类物质和一部分色素。通过加标回收实验发现，当GCB为30 mg、PSA为40 mg的用量时，除p,p’-DDT以外的大部分农药均具有较高的回收率，见图3与图4。

图2 超声提取条件下25种农药的回收率1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏剂、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 联苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯杀螨砜、20. 氯菊酯、21. 哒螨灵、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

图3 不同GCB用量对25种农药回收率的影响1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏剂、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 联苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯杀螨砜、20. 氯菊酯、21. 哒螨灵、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

2.5 工作曲线、线性范围及检出限的测定

配制25种农药的混标工作液，以峰面积对浓度做工作曲线，结果见表1。在相应浓度范围内，各农药的响应值与浓度具有良好的线性关系。以S/N=3计算方法检出限。25种有机氯和拟除虫菊酯农药的检出限在0.0040 mg/kg～0.0108 mg/kg之间，25种农药分离的色谱图见图5。

图4 不同PSA用量对25种农药回收率的影响1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏剂、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 联苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯杀螨砜、20. 氯菊酯、21. 哒螨灵、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

图5 25种有机氯和拟除虫菊酯农药的GC-ECD色谱图1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏剂、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 联苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯杀螨砜、20. 氯菊酯、21. 哒螨灵、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

2.6 方法的回收率和精密度

在空白茶叶基质中分别加入适量的农药标准品，使各农药的加标浓度为10倍定量限(S/N=10)，实验平行操作5次，计算方法的回收率和相对标准偏差，结果见表1。

表1 25种有机氯与拟除虫菊酯农药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限、回收率和相对标准偏差

2.7 方法的应用

针对企业开发的前处理方法分析一个茶叶样品，需要有机溶剂10 mL，处理时间约40 min，分散固相填料成本低于5元，适用于茶叶企业监测茶叶中的农药残留风险。应用本方法对2个绿茶样品和2个花茶样品进行上述25种有机氯和拟除虫菊酯类农药的筛查检测，结果见表2。实验显示4个茶叶样品全部被检出农药残留，但残留量均低于GB 2763-2012中对茶叶农药最大残留限量的规定。

3 结论

采用超声提取、分散固相萃取净化-气相色谱建立了茶叶中25种有机氯和拟除虫菊酯类农药的分析方法。方法的检出限(S/N=3)是0.0040～0.1084 mg/kg；在10倍定量限(S/N=10)的添加水平，大部分农药的平均回收率在70.00～105.00%之间；相对标准偏差RSD(n=5)是5.07%～11.29%。同普通SPE方法相比，所建方法快速简便、成本低廉，具有在企业推广应用的实际意义。

表2 实际样品检测结果 (mg/kg)

(ND: 未检出)

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