嗜热芽孢杆菌噬菌体的分离及特征研究

晏爱芬，余丽，林连兵

1.保山学院 资源环境学院，云南 保山 678000；2.昆明理工大学 生物工程技术研究中心，云南 昆明 650224

噬菌体是一类寄生在古生菌和真细菌中的病毒，是体积微小、结构简单、性质特殊的生命形态。随着对噬菌体在生物学和医学领域中地位的认识不断加深，高温噬菌体引起了越来越多科研工作者的关注，因为它们不仅可以作为一种模式系统，用于研究地热区生物的分子生物学及生物化学特性，而且还深刻影响着生物地球化学和生态系统的进化过程，包括遗传转换、营养循环、生物种群结构、生物分类、生物进化[1]等。对腾冲热海嗜热芽孢杆菌噬菌体的研究，不仅可以了解它们在腾冲热海中的分布及特征，还有助于丰富我国嗜热噬菌体资源。

本文报道了分离自腾冲热海热泉的一株嗜热芽孢杆菌噬菌体，我们对其进行了电镜形态观察、生理特征初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

噬菌体分离所用的宿主菌嗜热芽孢杆菌为本实验室保存；从云南省腾冲县热海热泉采集水样及沉积物，室温保存于无菌的离心管中，采样点温度为50～75℃，pH值为7.0～8.0。

高温菌培养基DSM88[2]，调节pH值为7.5；固体培养基的琼脂浓度为2%，半固体培养基的琼脂浓度为1%。

1.2 噬菌体的分离及纯化

采用双层平板法分离嗜热噬菌体[3]。取20 mL热泉样品接种到200 mL DSM88液体培养基中，55℃、200 r/min振荡过夜，所得培养液经0.22 μm灭菌滤膜过滤除菌后，取100 μL滤液与350 μL培养至对数生长期早期的嗜热芽孢杆菌混合，室温静置10 min后与3 mL半固体培养基混匀，均匀倾倒在DSM88固体平板上，即形成双层平板；将双层平板置于密封袋中，55℃培养过夜；肉眼观察到噬菌斑后，用牙签挑取单个噬菌斑，溶于DSM88液体培养基中，作为下次感染的病毒储液感染宿主细胞，经3次纯化获得纯噬菌体。

1.3 噬菌体的形态观察

取纯化后的噬菌体（效价为108pfu/mL）10 μL，用一定量的2%醋酸双氧铀染色，吸附于230目铜网（喷涂碳膜）上，干燥后用JEOL-TEM1400透射电子显微镜观察。

1.4 最佳感染复数的测定

感染复数（multiplicity of infection，MOI）是指初始感染时加入噬菌体的数量与宿主菌数量的比值，也称感染倍数。参照Lu等[4]的方法，略有改动。培养宿主菌NHH4至对数前期，用分光光度计测定此时的 D600nm值约为 0.2，相当于 1×108CFU/mL；按照MOI分别为0.01、0.1、1、10和100的比例，加入噬菌体纯培养液和宿主菌，加入DSM88培养基使各管总体积相同；在55℃摇床中160 r/min振荡培养8 h，13 000×g离心10 min，收集上清测定噬菌体滴度；各点均作2份复管培养，取平均值，同时以不加噬菌体的宿主菌和不加宿主菌的噬菌体为对照，以产生最高噬菌体滴度的MOI为最佳感染复数。

1.5 物理因素对噬菌体活性的影响

1.5.1 噬菌体的热稳定性分析[5]取滴度为2.1×108pfu/mL的噬菌体悬液1 mL，分别置于50、55、60、65℃水浴锅中，每隔10 min取一次样，共取5次，测定各温度梯度下不同时间的噬菌体滴度 。

1.5.2 噬菌体pH稳定性分析[5]取pH值分别为4、5、6、7、7.5、8、9、10、11的DSM88培养基0.99 mL，加入1.5 mL灭菌离心管中，加入0.01 mL滴度为2.1×108pfu/mL的噬菌体悬液，室温静置1 h，用DSM88培养基稀释至1/10，取20 μL与350 μL对数期宿主细胞混合，室温静置15 min后测定滴度。

2 结果

2.1 噬菌体的分离和纯化

把不同采样点的富集样品过滤除菌得到的病毒储液，与培养至对数期的不同菌株吸附，采用双层平板法检测是否有噬菌斑形成。结果NHH4菌株的菌苔可见清新、透明的噬菌斑，直径2～4 mm（图1）。反复挑取3次纯化噬菌体，在合适的液体培养条件下分离到1株噬菌体能快速裂解宿主菌，使培养液变得澄清，噬菌体滴度较高，一般可达108pfu/mL以上；电镜观察，可见形态均一的噬菌体颗粒。

2.2 噬菌体电镜形态

用灭菌牙签把双层平板上的噬菌斑挑到液体培养基中培养24 h，对噬菌体培养液超速离心浓缩，于电镜下观察，噬菌体颗粒为二十面体型，直径为80～100 nm，无尾，未见刺突，衣壳较薄，截面呈六边形，边长60～80 nm（图2）。根据其形态，将感染嗜热芽孢杆菌NHH4的噬菌体命名为嗜热芽孢杆菌二十面体噬菌体（thermophilicBacillusicosahedral phage，TBIP1）。

2.3 噬菌体TBIP1的最佳MOI测定

加入噬菌体和宿主菌培养8 h后，宿主菌被充分裂解，培养液变得澄清，计数各测定管中的噬菌体滴度，结果见表1。当MOI为1、0.1和0.01时，噬菌体TBIP1感染其宿主菌NHH4产生的子代噬菌体的滴度较高；当MOI为1.0时，子代噬菌体滴度为1.09×109PFU/mL，在所有MOI中，该产出率最高。因此，确定噬菌体TBIP1感染其宿主嗜热芽孢杆菌NHH4的最佳MOI为1.0。

图1 噬菌体在平板上形成的噬菌斑形态

图2 二十面体噬菌体TBIP1的形态

表1 噬菌体TBIP1的感染复数测定

2.4 物理因素对噬菌体TBIP1活性的影响

2.4.1 温度对噬菌体活性的影响 宿主菌NHH4在45～65℃可被TBIP1感染，以培养温度为55℃时获得的噬菌体滴度最高，培养液中噬菌体滴度可达2.8×108pfu/mL。热稳定性分析（图3）表明，TBIP1在55℃最稳定，随着温度升高，其存活率降低，65℃处理20 min后噬菌体失活。

2.4.2 pH值对噬菌体活性的影响 pH值的改变对噬菌体TBIP1滴度的影响较大，从图4可以看出，在pH为5～9时，噬菌体均保持45%以上的活性，尤以pH7.5时滴度最高；随着pH值的升高，噬菌体TBIP1的活性快速降低，pH11时噬菌体完全失去感染宿主的能力；当pH值降到4时滴度为零。相比之下，TBIP1在较为温和的pH值环境下有较好的稳定性。

3 讨论

高温噬菌体生活在一类特殊的环境中，对温度具有很强的耐受力和适应性，它们通过侵染嗜热细菌而生存繁殖，具有独特的分子生物学和生物化学特性。噬菌体TBIP1是分离自从腾冲热海温泉中得到的嗜热芽孢杆菌NHH4的一株新的烈性噬菌体。TBIP1在DSM88培养基中能够很好地感染宿主菌NHH4并形成清晰的噬菌斑，感染宿主菌的温度范围为45～65℃，最适感染温度为55℃；感染宿主菌的pH值范围为5.0～10.0，最适感染pH值为7.5。根据对噬菌体TBIP1的生物学特征分析，认为噬菌体TBIP1比较典型。

腾冲热海作为我国著名的火山地热区，具有不同水化学特征的温泉类型，与之对应的漫长的微生物生态系统的演化，孕育出了现代腾冲热海丰富的高温微生物资源。已从腾冲热海中分离到硫化叶菌噬菌体[6]、栖热菌噬菌体[5]，可见腾冲热海的嗜热菌及其噬菌体都具有生物多样性。腾冲热海作为我国重要的高温菌及其嗜热噬菌体资源宝库，值得进一步研究。

图3 温度对噬菌体TBIP1活性的影响

图4 不同pH值对噬菌体TBIP1活性的影响

[1]Fuhrman J A.Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects[J].Natue,1999,399:541-548.

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