HPLC-ELSD法测定清开灵滴丸中胆酸和猪去氧胆酸的含量

陈文静, 滕 奇, 王崇益

(江苏正大清江制药有限公司, 江苏 淮安 223001)

HPLC-ELSD法测定清开灵滴丸中胆酸和猪去氧胆酸的含量

陈文静, 滕 奇, 王崇益

(江苏正大清江制药有限公司, 江苏 淮安 223001)

建立了高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定清开灵滴丸中胆酸和猪去氧胆酸含量的方法．采用汉邦C18色谱柱(200mm×4.6mm,5μm),流动相为0.1%甲酸-甲醇-乙腈溶液(25∶60∶15),柱温30℃,漂移管温度为105℃,空气流速2.2L/min．胆酸和猪去氧胆酸的进样浓度分别在0.598～1.596mg/mL(r=0.9992)和0.600～0.1.600mg/mL(r=0.9995)范围内其线性关系良好,胆酸和猪去氧胆酸平均回收率分别为99.74%和99.21%．该方法准确,简便,分离度高,重现性好,可用于清开灵滴丸中胆酸和猪去氧胆酸含量的测定．

HPLC-ELSD法; 清开灵滴丸; 胆酸; 猪去氧胆酸; 含量测定

0 引言

清开灵滴丸是由胆酸、珍珠母、板蓝根、黄芩苷、金银花、猪去氧胆酸、黄芩、水牛角等八味中药材,经过中药提取、固体制剂等生产工艺制成棕褐色的滴丸．功能主治为清热解毒,镇静安神．用于外感风热时毒,火毒内盛所致高热不退,烦躁不安,咽喉肿痛,舌质红绛、苔黄、脉数者;上呼吸道感染,病毒性感冒,急性化脓性扁桃体炎,急性咽炎,急性气管炎,高热等病症属上述证候者[1]．胆酸和猪去氧胆酸含量测定是清开灵滴丸质量控制项目之一,现有的国家药品标准中胆酸和猪去氧胆酸含量测定分别在高效液相色谱-紫外检测和高效液相色谱-蒸发光散射检测两个系统检测．笔者根据文献[2-5]采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法把胆酸和猪去氧胆酸含量测定放在一个系统中检测．实验结果表明该方法准确,简便,分离度高,重现性好,可为保障药品质量提供科学依据．

1 仪器与试剂

1.1 仪器

seriesII泵(Lab Alliance美国);PL-ELS2100蒸发光散色检测器(英国Polymer Labotaries);CA3无油空气泵(武汉科林科技公司);Hanbon Lichrospher C18色谱柱(200mm×4.6mm,5μm);HEATER AB-230A柱温箱;浙江大学N2000色谱工作站．

1.2 试剂

甲醇为色谱纯(汉邦科技有限公司,批号82456);甲酸为分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司);色谱用水为超纯水;胆酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号10087-200414),猪去氧胆酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号10087-200610).

1.3 样品

清开灵滴丸(江苏正大清江制药有限公司,批号080418,080419,080420)．

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.1%甲酸-甲醇-乙腈溶液(25∶60∶15) 为流动相;柱温30℃．用蒸发光散射检测器检测,漂移管温度为105℃;气体流速2.2L/min．理论板数按胆酸峰计算应不低于2000,胆酸和猪去氧胆酸的分离度不小于1.5,进样品20μL．

2.2 对照品溶液的制备

分别准确称取胆酸、猪去氧胆酸对照品适量,加甲醇溶解,制成每1mL含胆酸0.8mg、猪去氧胆酸0.8mg的混合对照品溶液,和每1mL含胆酸1.6mg、猪去氧胆酸1.6mg的混合对照品溶液．

2.3 供试品溶液的制备

取清开灵滴丸细粉5.0g,准确称定,置于具塞锥形瓶中．加甲醇25mL,称定重量,超声处理20min,放冷至室温．再称定重量,加甲醇补足减失的重量．摇匀,滤过,弃去初滤液,准确吸取滤液3mL至10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得．

2.4 阴性对照溶液的制备

按清开灵滴丸制备过程,缺胆酸和猪去氧胆酸的阴性样品,取5.0g 按本文方法制备阴性对照溶液．

2.5 测定方法

分别准确吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL分别注入液相色谱仪,测定峰面积,以外标二点法对数方程计算,即得．

2.6 专属性

分别准确移取溶剂、混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，注入液相色谱仪,记录图谱．两个相邻色谱峰的分离度均大于1.5,其他杂质成分对样品检测无干扰．实验结果表明，该方法的专属性良好．

2.7 线性关系检测

准确称取胆酸、猪去氧胆酸适量,用甲醇制备成浓度分别为 0.6,0.8,1.0,1.2和1.6mg/mL的对照品溶液．各准确量取20μL注入液相色谱仪,记录色谱图,测定峰面积,以峰面积值log(A)为纵坐标,对照品进样浓度log(C)为横坐标,绘制标准曲线,胆酸的回归方程见表1.

表1 线性关系检测结果

2.8 精密度试验

准确吸取胆酸和猪去氧胆酸对照品溶液,进样20μL,重复进样6次,测定峰面积,胆酸和猪去氧胆酸RSD分别为1.27%和0.92%

2.9 重现性试验

取同一批样品,按选定方法制备供试品溶液6份,分别注入液相色谱仪测定含量,胆酸和猪去氧胆酸的RSD(n=6)分别为0.52%和0.75%．

2.10 稳定性试验

准确吸取供试品溶液,分别于0，3，6，9，12和24h,进样,记录峰面积,结果胆酸和猪去氧胆酸RSD(n=6)分别为1.57%和1.25%．

2.11 加标回收率试验

准确称取胆酸和猪去氧胆酸的阴性样品5.0g,分别置于9个具塞锥形瓶中．再在上述具塞锥形瓶中准确加入一定量的胆酸,猪去氧胆酸．做为约含标示量90%、100%和110%的样品,按选定方法制备供试品溶液．进样测定,计算加样回收率,结果见表2和表3．

表2 胆酸的加样回收率试验结果(n=9)

表3 猪去氧胆酸的加样回收率试验结果(n=9)

2.12 样品测定

取清开灵滴丸滴丸3批,按照选定方法制备供试品溶液．分别取混合对照品溶液和各供试品溶液进样测定,以外标二点法对数方程计算,结果见表4.

表4 三个批次样品含量测定结果

3 讨论

3.1 检测器的选择

《国家药品标准》中高效液相-紫外检测清开灵滴丸中胆酸含量[1],采用紫外检测器,检测波长为192nm,在近紫外区测定,胆酸仅有末端吸收,基线漂移较大,检测结果受外界条件影响大．但在实际工作中，对0.1mg/mL胆酸,0.1mg/mL猪去氧胆酸的甲醇溶液进行紫外扫描发现,胆酸、猪去氧胆酸的甲醇溶液分别在213nm和219nm处有最大吸收,因为常用HPLC级别的甲醇在210nm处紫外吸收值通常为0.5(以1cm石英比色皿水作对照),故此区域内甲醇对样品的背景吸收很大,容易对样品测定造成干扰．

虽然在260～400nm范围内,色谱级甲醇的紫外吸收值为0.01(以1cm石英比色皿水作对照)可以排除甲醇背景吸收对检测的干扰,而且胆酸、猪去氧胆酸的甲醇溶液分别另外在264nm和263nm处有较大吸收峰．然而被测样品清开灵滴丸,由8种中药材提取,其他多组分在此波长处也有较强吸收,会干扰样品检测,影响结果的准确度．

综上考虑,蒸发光散射检测器作为一种通用型质量检测器,可有效排除溶剂甲醇对检测结果的干扰,提高检测结果的准确性．高效液相-蒸发光散射检测清开灵滴丸中胆酸和猪去氧胆酸含量,在合适的漂移管温度和气流下,基线稳定,分离效果好,而且胆酸和猪去氧胆酸含量测定在同一测试条件下,操作简便,重复性好．故选择蒸发光散射检测器做为本方法的检测器．

3.2 计算方法的选择

实验表明,蒸发光散射检测器的响应值与被测物浓度的关系曲线比较复杂,在较高浓度范围内呈线性;而在低浓度范围内会呈指数关系．为了考察不同计算方法对准确度的影响,故将十个批次清开灵滴丸中胆酸、猪去氧胆酸实际含量,用不同计算方法处理测得值，将其结果进行对比．表5和表6分别列举了用外标两点法直线方程、外标一点法直线方程、外标两点法对数方程对数据进行处理的结果．

通过数据处理对比可知，当对照溶液浓度与被测物质浓度相差较小时检测结果准确度较好(胆酸平均回收率95.0%,猪去氧胆酸平均回收率97.5%),但当对照溶液浓度与被测物质浓度相差较大时检测结果准确度很差(胆酸平均回收率139.2%,猪去氧胆酸平均回收率147.9%),为此采用一点外标法计算清开灵滴丸中胆酸、猪去氧胆酸的含量不合适．采用外标两点法直线方程计算结果准确度较好(胆酸平均回收率98.8%,猪去氧胆酸平均回收率99.4%),但相比较而言采用外标两点法对数方程准确度更好(胆酸平均回收率100.2%,猪去氧胆酸平均回收率100.3%)．

由此可知,当胆酸和猪去氧胆酸进样浓度分别在0.598～1.596mg/mL和 0.600～0.1600mg/mL范围内,采用外标两点法对数方程法，其浓度的对数值与各自峰面积值的对数值呈良好的线性关系,计算结果与理论含量最为接近，而且该线性为不通过原点的直线。因而本文采用外标两点对数法计算供试品的含量．

表5 十个批次胆酸三种计算方法结果对比表 (%)

注:*胆酸对照溶液浓度为0.598mg/mL；**胆酸对照溶液浓度为1.596mg/mL．

表6 十个批次猪去氧胆酸三种计算方法结果对比表 (%)

注:*猪去氧胆酸对照溶液浓度为0.600mg/mL；**猪去氧胆酸对照溶液浓度为0.1600mg/mL．

3.3 其他因素对检测结果的影响

蒸发光散射检测器在使用过程中气体压力的波动会对检测产生影响,因此高效液相-蒸发光散射检测要求气体流速,压力稳定,如果气源是两台或者更多仪器共享,当支流气体流速变小时,高效液相-蒸发光散射检测器测定的峰面积有影响．选用空气泵做蒸发光散射检测器气源要控制空气泵输出的气压值波动不能超过±0.05MPa．

[1] 国家食品药品监督管理局. YBZ00872005国家药品标准(试行)[S]. 北京：中国标准出版社，2002.

[2] 江英桥.HPLC-ELSD法测定清开灵注射液中的胆酸和猪去氧胆酸含量[J].中国药品标准,2006,7(4):31-39.

[3] 谢志宏,周寿,汪晓凌,等. HPLC-ELSD法测定清开灵栓中的胆酸和猪去氧胆酸含量[J].中国药房,2009,20(9):696-702.

[4] 张莉,缪建国. HPLC法测定清开灵注射液中猪去氧胆酸含量[J]. Chinese Journal of Infornation on TCM,2007,14(10):46-52.

[5] 高敏.清开灵滴丸中猪去氧胆酸HPLC含量测定方法.哈尔滨医药[J]. 2008,28(4):45-50.

DeterminationofCholaiicAcudandHyodeoxycholicAcidinQingkailingDiwanbyHPLC-ELSD

CHEN Weng-jin, TENG qi, WANG Chong-yi

(Jiagsu Chiatai Qingjiang Pharmaceutical CO., LTD., Jiagsu Huaian 223001, China)

To establish the contents of Cholaiic Acud and Hyodeoxycholic Acid in Qingkailing Diwan by high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection (HPLC-ELSD). Methods: The analytical column was Hanbon Lichrospher C18 column (200mm×4.6mm, 5μm); mobile phase was 0.1% formic acid-methanol-acetonitrile (25∶60∶15); column temperature of 30℃; drift tube temperature of 105℃, flow rate of the air at 2.2L/min. Results: A better linearity and good correlation coefficient were obtained Cholaiic Acud was 0.598～1.596 mg/mL(r=0.9992) and Hyodeoxycholic Acid was 0.600～0.1.600 mg/mL (r=0.9995).Cholaiic Acud and Hyodeoxycholic Acid, average recoveries were 99.74%(RSD=1.4% n=9), 99.21%(RSD=1.0% n=9). Conclusion: The method is accurate, simple, Well-separated, it can be used applicable Cholaiic Acud and Hyodeoxycholic Acid by Qingkailing Diwan.

HPLC-ELSD; qingkailing diwanl; cholaiic acud; hyodeoxycholic acid; content determination

2012-11-02

陈文静(1965-), 女, 江苏淮安人, 工程师, 主要从事药品质量检测.

R286

A

1671-6876(2013)03-0236-04

[责任编辑蒋海龙]