亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白提取方法的比较

王 滔，杨 巽，衣建坤，王 玉，孙 宇，席景会

(吉林大学植物科学学院，长春 130062)

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis属于鳞翅目，螟蛾科，蛀食性害虫，是危害玉米的主要害虫之一，玉米是我国重要的粮食作物，每年由于亚洲玉米螟的为害造成大量损失，所以防治亚洲玉米螟有着重要的意义。昆虫具有开放的体液循环系统，其血淋巴负担着重要的物质和能量的转运功能，而其中的血浆蛋白正是行使这些功能的主要成员(杨捷频等，2009)，在昆虫的防御、抗冻、免疫(Jana et al.，2012)、损伤应答等方面起重要作用(王岩等，2009)，所以血浆蛋白提取方法的比较为研究昆虫生理生化活动及其分子机制提供了基础，昆虫蛋白制备方法较多，但是对于鳞翅目幼虫的血浆蛋白制备方法基本大多数都是直接裂解法(钟伯雄等，2003;崔颖俊等，2008)，对于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的效果并不理想。为了探寻更理想的血淋巴制备方法，本研究比较了3种蛋白质提取方法，为后续进一步的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试虫:亚洲玉米螟饲养于实验室培养箱中，采用人工饲养(乔利等，2008)，温度控制26±0.5℃，光周期16L∶8D，相对湿度75%～85%，收集5 龄幼虫作为试虫。

1.2 血淋巴的提取方法

将试虫冷冻麻醉，剪掉腹足，吸取血淋巴，配合双管离心法(Xu et al.，2006)，收集血淋巴，-80℃中储存备用(Britto et al.，2012)。

1.3 蛋白样品制备

1.3.1 三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法

参照Mechin 等报道的方法(Mechin et al.，2007)，略作修改。取-80℃血淋巴样品，4℃离心取上清，分装每管20μL，加 TCA/丙酮，-20℃沉淀，4℃ 离心弃上清，将沉淀用丙酮和80%丙酮各洗1 遍，沉淀真空离心干燥1 min，蛋白粉末-80℃冰箱中储存备用。

1.3.2 PEG 提取法

取-80℃血淋巴样品，4℃离心，取上清，分装为每管20μL，加入80μL 50%的PEG，使终浓度为40%，冰浴1 h，4℃离心，弃上清，将沉淀用丙酮和80% 丙酮各洗一遍，真空离心干燥1 min，蛋白粉末-80℃冰箱中储存备用。

1.3.3 直接裂解法

参考Nguyen 等的方法(Nguyen et al.，2007)，取-80℃血淋巴样品，4℃离心，取上清，分装为每管20μL，加入200μL 4℃预冷的裂解液，4℃离心两次取上清分装，样品冻存于-80℃冰箱中备用。

1.4 蛋白样品的溶解

取冻存的蛋白质样品，加入溶解液［5M 尿素，2M 硫脲，2% CHAPS，20 mM DTT，0.002%溴酚蓝］中，30℃孵育1.5 h，充分溶解后于13000 rpm离心30 min，取上清进行蛋白浓度测定。

1.5 蛋白含量的测定

参照Bradford 法进行蛋白质浓度的测定(Toyama et al.，2007)。

1.6 SDS-PAGE 电泳

采用不连续垂直板十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。分离胶浓度12.5%，浓缩胶浓度3%，凝胶厚度为1 mm，银染方法进行凝胶染色(Yan，2000)，染色后凝胶用Epson Expression 10000XL 扫描仪进行扫描，重复3 次，并利用Quantity One 软件进行图像分析。

1.7 双向电泳

取300μg 蛋白，补加水化液至340μL，胶条为pH4～7 的18 cm 的IPG 胶条，在水化槽中室温水化16 h，等电聚焦仪中等电聚焦，之后每根胶条在平衡缓冲液Ⅰ和平衡缓冲液Ⅱ中平衡15 min。然后将胶条转移至12.5%浓度，厚度为1.5 mm 的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上，进行第二向垂直电泳，银染方法进行凝胶染色(Yan，2000)，染色后凝胶用Epson Expression 10000XL 扫描仪进行扫描，每个方法三次重复，然后利用ImageMasterTM2D Platinum 6.0 软件进行图像分析。

2 结果与分析

2.1 不同方法的蛋白提取率

用3种方法获得的亚洲玉米螟血浆蛋白的提取率有明显不同，结果见图1，直接裂解法的提取率最高，为41.91μg/μL，TCA/丙酮沉淀的提取率次之，为14.32μg/μL，PEG 提取法的提取率为8.47μg/μL。利用SPSS13.0 统计软件，利用One-Way ANOVA 进行分析，采用LSD 法进行多重比较，结果表明:3种蛋白提取方法的蛋白提取率具有极显著差异(P＜0.01)。

图1 不同提取方法的蛋白质提取率Fig.1 The rate of protein in extraction from different ethods

2.2 SDS-PAGE 电泳图谱分析

三种方法提取的血浆蛋白SDS-PAGE 电泳结果见图2，PEG 提取法得到的蛋白在图谱上显示的条带数最多，为39 条，且从14.4 kDa～116 kDa的范围内分布均匀，条带清晰;TCA/丙酮沉淀法得到的蛋白条带明显减少，只有23 条，主要集中于35.0 kDa 以上，低分子量的蛋白条带明显减少，70 kDa 附近蛋白表达量过大，使蛋白条带不易分辨;直接裂解法得到的蛋白在图谱上显示的条带数仅为22 条，除高分子量的条带清楚外，小分子量的条带可辩率很低。

2.3 双向电泳图谱分析

为了进一步检测亚洲玉米螟血浆蛋白质制备效果，对不同制备方法得到的蛋白样品进行双向电泳分析，结果如图3和图4，直接裂解法获得332个蛋白质点，PEG 提取法获得874个蛋白质点，而TCA/丙酮沉淀法制备的样品只得到210个蛋白质点。其中PEG 提取法得到的双向电泳图谱背景较清晰，蛋白分布最广，在各个分子量和等电点区域得到的蛋白点都是最多的，分离效果较好。直接提取法的图谱中的蛋白点明显少很多，从图谱中可见，各个区域显现的蛋白点数具有不同程度减少，相同蛋白的表达丰度也有不同程度的降低。TCA/丙酮沉淀法的图谱得到的蛋白点数最少，且得到的蛋白点有明显的弥散情况，相同的蛋白的表达丰度也明显的降低。另外PEG 提取法得到的电泳图谱重复性较好，TCA/丙酮沉淀法次之，直接提取法重复性较差。

图3 不同蛋白提取方法的2-DE 凝胶图谱Fig.3 2-DE analyses of proteins from different methods

3 结论与讨论

TCA/丙酮沉淀法是常用的蛋白质提取方法(Xu et al.，2007)，这种方法能高效的去除蛋白质样品中的盐离子，并且能减少蛋白质水解作用和其它蛋白酶的修饰对蛋白分离结果的影响(安少利等，2010)。TCA/丙酮法是对蛋白进行多次沉淀后得到的样品，制备的蛋白样品为淡黄色粘稠状沉淀，加蛋白溶解液溶解后有大量胶状不溶物，再溶性很差，易造成很多蛋白质的损失，并且对色素，多糖等杂质的去除效果一般(Gorg et al.，2000)。亚洲玉米螟5 龄幼虫血淋巴有很多色素、多糖和脂类等干扰物质较多，所以用TCA/丙酮沉淀法提取血浆蛋白质得到的SDS-PAGE 蛋白条带数较少，2-DE 图谱所检测到的蛋白点数也是最少的。

直接裂解法提取蛋白的原理是将蛋白质溶解在裂解液中，主要针对可溶性蛋白，其操作布骤简单，方便快速，有利于蛋白降解，加上成本较低，在微生物的蛋白制备中广泛应用(Barrios-Llerena et al.，2007)。但是在亚洲玉米螟血浆蛋白的提取中，由于脂类、多糖等杂质的干扰，而此方法对杂质的去除效果差，使蛋白定量不准确，SDS-PAGE 中分离的条带较少且不清晰，进行双向电泳时，第一步IEF时电压不稳定，等电聚焦时间较长，使得蛋白质大量降解，所以图谱上显现的蛋白点很少，并且分布的范围较窄，并且有弥散的现象，所以此方法不适合定量比较研究，特别是进行差异蛋白质组的研究。

利用PEG 提取法制备的蛋白样品呈乳白色，加入蛋白溶解液溶解后只有少量不溶解，再溶性比较好，进行SDS-PAGE和2-DE 图谱的效果都比较好，得到的点是最多的也是分布最广的，分离情况也较好。

因此，利用PEG 提取法进行亚洲玉米螟血浆蛋白样品的制备，蛋白点数最多，分布最广泛，分辨率高，重复性好，适于进行后续差异蛋白质组的相关研究。

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