葛根素对脑缺血大鼠脑组织MMP-9表达和脑水肿的影响

封 菲 洪鸣鸣 高 越 杭州市第一人民医院老年科 杭州310003

基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9，MMP-9）属于基质金属蛋白酶家族，能够降解和重塑细胞外基质。已有研究［1］，证实脑缺血再灌注后MMP-9 表达增多，并通过降解基底膜和连接蛋白而破坏血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），导致血管源性脑水肿。葛根素是从葛根中提取的一种异黄酮类化合物，有研究［2］证实，葛根素具有扩张脑血管，改善微循环，抗血小板聚集，从而降低血液黏滞度以及抗氧自由基等多重途径起到脑保护的作用。本研究拟通过观察葛根素对大鼠脑缺血再灌注后是否能抑制MMP-9的表达，减轻血脑屏障的破坏和脑水肿，探讨葛根素脑保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备及处理 成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠54只，体质量250～300g，清洁度Ⅱ级，由浙江省医学科学院动物中心提供，随机分为假手术组、对照组和药物组，每组18只，各组再平均分为三个亚组，分别用于血脑屏障通透性测定、脑含水量测定及免疫组化。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，按照Bederson 等［3］的方法制作大鼠脑缺血再灌注模型，手术前后大鼠肛温维持在（37±0.5）℃。缺血90min 后抽提栓线至颈外动脉残端内进行再灌注。药物组于缺血前1h 给予葛根素注射液（剂量70mg/kg）腹腔内注射，随后每间隔8h 再次注射，对照组及假手术组给予等量生理盐水。

1.2 试剂和仪器 葛根素注射液（浙江康恩贝制药公司）、伊文思蓝（Evan's blue，EB）溶液（sigma 公司）、兔抗大鼠MMP-9 多克隆抗体、SABC 试剂盒及DAB 显色剂（武汉博士德生物公司）、Olympus-CH2显微镜（日本欧林巴斯光学工业株式会社）

1.3 BBB 通透性测定 大鼠处死前2h，尾静脉注入2%EB 2mL/kg。再灌注48h时，用1%肝素生理盐水经心室灌流，然后迅速取损伤侧脑组织，称取湿重后置入加有5mL 甲酰胺的试管中，54℃恒温培养箱孵育24h，让组织中的EB 充分溶解在甲酰胺溶液中。将溶有EB的甲酰胺溶液过滤，用分光光度计（波长632nm）测各管吸光度（A）值，并制作EB标准曲线得出线性回归方程，根据此线性回归方程计算溶液中EB浓度，以每克脑组织湿重所含EB的微克数（μg/g）表示BBB通透性。

1.4 脑组织含水率测定 采用干湿称重法。大鼠快速断头取脑，取右侧大脑半球用电子天平获取湿重，置入100摄氏度恒温干燥箱内48h再获取干重，脑组织含水率计算公式：（湿重-干重）/湿重×100%

1.5 脑组织MMP-9 表达 采用免疫组织化学技术检测。大鼠脑缺血再灌注48h时以4%多聚甲醛液约200mL经心脏灌注固定，快速断头冰盘上取脑，视交叉和其后4mm 处两点冠状切片，片厚4mm，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、用切片机连续5mm 厚冠状切片。石蜡切片经常规脱蜡、水化、煮沸法修复，过氧化氢阻断，滴加兔抗大鼠MMP-9 多克隆抗体（工作浓度1：100），根据SABC试剂盒说明书对切片标本进行操作，予DAB 显色，自来水冲洗后苏木素复染，脱水、封片，表达MMP-9 处在光镜下为棕黄色物质。每张切片先在低倍镜下观察，在脑梗死皮质缺血区的位置随机采集5个不重叠的高倍视野（×400），计数每张切片的总阳性细胞数。

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织EB 含量和含水率比较 对照组及药物组大鼠脑组织EB 含量及含水率较假手术组显著增加（P＜0.05）；与对照组比较，药物组脑组织EB含量及含水率明显减少（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠脑组织EB含量及脑组织含水率比较（）

表1 各组大鼠脑组织EB含量及脑组织含水率比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，△P＜0.05

2.2 各组大鼠脑组织MMP-9 表达 三组大鼠的左侧（未缺血侧）大脑半球基本未见阳性细胞（每张切片的5个高部视野下MMP-9 总阳性细胞数为1.33±1.20），而对照组和药物组大鼠的右侧大脑半球皮质缺血区均可见胞浆呈棕黄色的MMP-9 阳性细胞表达。药物组MMP-9 阳性细胞数（33.50±2.17），较对照组（38.17±3.13）明显减少（P＜0.05）。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是临床上脑外伤、脑肿瘤、脑血管病等许多疾病伴发的常见病理损害过程，脑缺血再灌注损伤后的直接结果是形成脑水肿，而血管源性水肿是脑水肿的始动因素，在脑组织含水量和颅内压变化中起着关键作用，也是针对脑水肿采取干预措施的主要对象。

MMPs是参与组织重塑的锌依赖的内肽酶，正常时以酶原形式存在，在细胞外激活，MMPs 可降解多种细胞外基质蛋白包括血脑屏障的神经血管基底膜和紧密连接蛋白因而成为研究热点［4］。它的调节是复杂和严格的过程，其调节失控与创伤性脑损伤、脑卒中及神经变性时血脑屏障破坏和突触丢失相关［5-8］。MMP-9 基因缺失小鼠在脑外伤及卒中［9-10］的对照试验中均出现水肿和炎症反应的减轻及脑白质完整性和神经功能的改善。一系列应用MMP 抑制剂的实验也证实可减轻脑水肿和脑梗死。但也有研究证实MMP具有双相作用［11］。它在脑外伤和卒中后康复阶段的神经再生、神经血管重塑中起重要作用［11-12］。

Rosenberg 等［13］发现在脑缺血再灌注损伤后24h MMP-9开始有表达，48h后可在血管内皮细胞、中性粒细胞、神经元中观察到MMP-9阳性细胞表达。多项研究发现脑缺血再灌注后MMP-9 表达高峰和BBB破坏及脑水肿高峰均在脑缺血再灌注后48h。

本实验选取脑缺血再灌注后48h为时间点，发现缺血再灌注后大鼠缺血区周边皮质内皮细胞、神经细胞中MMP-9表达显著增多，血脑屏障通透性和脑组织含水率也显著增加，表明MMP-9参与了脑缺血再灌注损伤；本实验中药物组大鼠缺血侧脑组织内的EB 含量和脑组织含水率也较对照组下降（P＜0.05），提示葛根素干预后脑缺血再灌注大鼠BBB破坏程度和脑水肿得到减轻；研究还发现葛根素干预可减少大鼠脑缺血再灌注48h 后MMP-9的表达，我们推测葛根素可能通过下调MMP-9表达，减轻BBB的破坏和脑水肿，从而在脑缺血再灌注损伤中发挥其保护作用。

葛根素在临床上广泛地应用于缺血性脑血管病的治疗。葛根素具有扩张脑血管，改善微循环，降低血浆内皮素，抗血小板聚集，抗氧自由基，缓解脑血管痉挛，阻断局部缺血缺氧及细胞内钙超载的恶性连锁反应，抑制诱生型NO 合酶系统的激活，干预细胞凋亡等作用［2］。本研究表明，葛根素可能通过抑制MMP-9的活化和减轻血脑屏障通透性起到脑缺血再灌注损伤的脑保护作用。

［1］Rosenberg GA，Yang Y.Vasogenic edema due to tight junction disruption by matrix metalloproteinases in cerebral ischemia［J］.Neurosurg Focus，2007，22（5）：E4.

［2］潘洪平，杨嘉珍，莫祥兰，等.葛根素注射液对急性脑缺血模型大鼠脑细胞损伤的保护作用［J］.中国中药杂志，2005，30（6）：457-459.

［3］Berderson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472-476.

［4］Grossetete M，Phelps J，Arko L，et al.Elevation of matrix metalloproteinases 3 and 9 in cerebrospinal fluid and blood in patients with severe traumatic brain injury［J］.Neurosurg，2009，65（4）：702-708.

［5］Candelario-Jalil E，Yang Y，Rosenberg GA.Diverse roles of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in neuroinflammation and cerebral ischemia［J］.Neuroscience，2009，158（3）：983-994.

［6］Ding JY，Kreipke CW，Schafer P，et al.Synapse loss regulated by matrix metalloproteinases in traumatic brain injury is associated with hypoxia inducible factor-1alpha expression［J］.Brain Res，2009，1268（5）：125-134.

［7］Rosenberg GA.Matrix metalloproteinases and their multiple roles in neurodegenerative diseases［J］.Lancet Neurol，2009，8（2）：205-216.

［8］Rosenberg GA，Yang Y.Vasogenic edema due to tight junction disruption by matrix metalloproteinases in cerebral ischemia［J］.Neurosurg Focus，2007，22（2）：E4.

［9］Asahi M，Wang X，Mori T，et al.Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on the proteolysis of bloodbrain barrier and white matter components after cerebral ischemia［J］.J Neurosci，2001，21（19）：7724-7732.

［10］Gidday JM，Gasche YG，Copin JC，et al.Leukocyte-derived matrix metalloproteinase-9 mediates blood-brain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289（2）：H558-H568.

［11］Zhao B-Q，Wang S，Kim H-Y，et al.Role of matrix metalloproteinases in delayed cortical responses after stroke［J］.Nat Med，2006，12（4）：441-445.

［12］Falo MC，Fillmore HL，Reeves TM，et al.Matrix metalloproteinase-3 expression profile differentiates adaptive and maladaptive synaptic plasticity induced by traumatic brain injury［J］.J Neurosci Res，2006，84（4）：768-781.

［13］Rosenberg GA，Cunningham LA，Wallace J，et al.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain activation of MMP-9 llinked to stromelysin-1 and microglia in cell cultures［J］.Brain Res，2001，893（1～2）：104-112.