玻璃珠表面修饰氨基的新型固相合成载体的制备*

王洁颖, 张首国, 温晓雪, 彭 涛, 颜海燕, 王 林

(1. 北京工业大学 生命科学与生物工程学院,北京 100022; 2. 军事医学科学院 放射与辐射医学研究所,北京 100850)

固相合成自20世纪60年代问世以来，经过半个多世纪的发展已经由最初的肽合成扩展到各类有机小分子及复杂的天然产物的合成，并以其独特优势带动了组合化学技术的兴起[1]。固相合成需要固相载体及连接固相和反应物的连接分子，正确选择载体和连接分子决定着固相合成的成功[2]。固相合成的载体多以聚苯乙烯和聚丙烯酰胺为基质，主要用于合成多肽[3]。但是, 这两类高聚物都缺乏结构上的刚性, 在多种溶剂及反应物中都有一定的溶解度。于是, 人们研究开发出了一系列新型固相载体以适应各种反应的需要, 如可控孔度玻璃(CPG)[4]。其他用于固相有机合成载体的材料还有滤纸、塑料棒等，而CPG一般适用于寡核酸的合成。玻璃是一种价廉易得的材料，只需将其加工成特定粒度，加以修饰即可进行固相载体的应用。其优点是具有一定的化学稳定性，基本上不溶于有机溶剂，具有一定的机械强度，良好的抗挤压和抗研磨性能。最大的优点是来源广泛，价格低廉，而这些是高聚物和其余的材料所不具备的。因此，开发以玻璃珠为基质的载体进行固相合成具有一定的创新和探索意义。

glass beads

Scheme1

随着以固相为支撑的蛋白芯片和生物传感器的发展，蛋白固定化的需求迅速增加。蛋白固定化在很大程度上依赖于基质表面的修饰[5]。由于玻璃能够耐高温和浸泡，可以负载微量样品并保持较低声噪，对于玻璃表面的修饰研究日渐深入[6]。其中，硅烷氨化是可以引入多种功能基团的最常用的修饰方法[7]。

1与连接分子4-[4-(羟甲基)苯氧基]-甲基苯甲酸(6)经过氨基与羧基缩合反应制得带连接臂的玻璃珠固相载体(7); 7与Fmoc保护的甘氨酸反应，再脱保护，成功地键合甘氨酸，充分证明1作为新型载体的可行性。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

RY-1型熔点仪(温度计未经校正);岛津UV-2501PC型紫外分光光度计;日本电子JNM-ECA-400型超导核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂,TMS为内标)。

玻璃珠(150目～200目),北京天历创玻璃有限公司;其余所用试剂均为市售分析纯。

1.2 1的制备[9,10]

在烧杯中加入纯净水300 mL和玻璃珠30 g,于100 ℃充分搅拌20 min;抽滤,玻璃珠依次在乙醇(75 mL)中于50 ℃，二氯甲烷(75 mL)中于35 ℃超声洗涤各2 min;置反应溶液[175 mL,V(25%NH3) ∶V(30%H2O2) ∶V(H2O)=1 ∶1 ∶5]中搅拌下于70 ℃反应30 min。用大量水洗涤至中性，置稀盐酸105 mL[V(37%HCl) ∶V(H2O)=1 ∶6]中搅拌30 min;用大量水洗涤至中性,依次用甲醇、甲醇/甲苯[V∶V=1 ∶1],甲苯超声洗涤各3 min，真空干燥过夜制得表面羟基化的玻璃珠。

在烧杯中加入Ⅰ 3 mL的甲苯(300 mL)溶液和表面羟基化的玻璃珠，于室温搅拌30 min。依次用甲醇、甲醇/甲苯、甲苯超声洗涤各3 min，于120 ℃真空干燥30 min，缓慢降至室温制得1，真空保存备用。

1.3 连接分子6的制备

在反应瓶中加入对甲基苯甲酸13.6 g(100 mmol)的苯(100 mL)溶液,搅拌下回流(80 ℃) 30 min;加入NBS(N-溴代丁二酰亚胺) 17.8 g(100 mmol),过氧苯甲酰0.2 g,回流反应24 h。蒸除溶剂,残余物用沸水充分混悬，抽滤，滤饼用大量沸水洗涤,甲醇重结晶得白色晶体对溴甲基苯甲酸(2),产率57.9%, m.p.233 ℃～235 ℃。

在反应瓶中加入2 2.15 g(10 mmol)的无水甲醇(60 mL)溶液,冰盐浴冷却，搅拌下滴加氯化亚砜2.06 g(17 mmol),滴毕,于室温反应过夜。蒸除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯，用去离子水洗涤3次，蒸除溶剂后经柱层析[梯度洗脱剂:A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=12 ∶1～10 ∶1]分离得白色固体对溴甲基苯甲酸甲酯(3) 1.87 g，产率81.5%, m.p.47 ℃～49 ℃;1H NMR(CDCl3)δ: 3.92(s, 3H), 4.55(s, 2H), 7.46(d,J=8.0 Hz, 2H), 8.02(d,J=8.0 Hz, 2H)。

在反应瓶中加入对羟基苯甲醛1.22 g(10 mmol)的丙酮(30 mL)溶液和碳酸钾1.38 g(10 mmol),搅拌下回流(60 ℃)反应5 min;缓慢滴加32.1 g(9.17 mmol)的丙酮(15 mL)溶液,滴毕,加入碘化钾0.13 g,回流反应7 h。过滤,滤液蒸干后用乙酸乙酯溶解，去离子水洗涤，蒸除溶剂后经柱层析(梯度洗脱剂:A=12 ∶1～8 ∶1)分离得白色固体4-[4-(甲酰基)苯氧基]甲基苯甲酸甲酯(4),产率69.7%;1H NMRδ: 3.87(s, 3H), 5.35(s, 2H), 7.23(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.62(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.90(d,J=8.4 Hz, 2H), 8.01(d,J=8.0 Hz, 2H), 9.89(s, 1H)。

冰盐浴冷却,在反应瓶中依次加入NaBH40.15 g(4 mmol)和1 mol·L-1NaOH溶液 8 mL,搅拌使其溶解，加入40.54 g(2 mmol)的甲醇(15 mL)溶液,反应6 h。用2 mol·L-1盐酸调至pH 1,析出沉淀，过滤，滤饼烘干得白色固体4-[4-(羟甲基基)苯氧基]甲基苯甲酸甲酯(5),产率98.7%。

在反应瓶中依次加入50.54 g(2 mmol)的甲醇(15 mL)溶液和1 mol·L-1NaOH溶液10 mL,搅拌下回流(90 ℃)反应2 h。蒸除溶剂,用2 mol·L-1盐酸调至pH 2,析出沉淀,抽滤,滤饼烘干得白色固体6 0.39 g,产率74.8%, m.p.212 ℃～214 ℃;1H NMRδ: 4.41(d, 2H), 5.06(t, 1H), 5.19(s, 2H), 6.97(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.23(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.55(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.96(d,J=8.0 Hz, 2H), 12.98(s, 1H)。

1.4 甘氨酸在1上的键合

在反应瓶中加入6 0.26 g(1 mmol)和混合溶剂(CH2Cl210 mL+DMF 2 mL),搅拌使其溶解,依次加入HOBt(1-羟基苯并三唑)0.15 g(1.1 mmol), NMM(N-甲基吗啉)0.30(3 mmol), TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸)0.32 g(1 mmol),充分搅拌15 min后加入1 22.5 g(氨基含量0.2 mmol),搅拌下于室温反应2 h(茚三酮检测玻璃珠不再显色)。抽滤，玻璃珠依次用二氯甲烷、甲醇、乙醚洗涤，烘干得7。

在反应瓶中加入Fmoc保护的甘氨酸0.30 g(1 mmol)和混合溶剂(CH2Cl210 mL+DMF 2 mL),搅拌使其溶解,依次加入HOBt 0.15 g(1.1 mmol), DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)0.13 g(1 mmol),充分搅拌后加入7和少量DMAP(4-二甲氨基吡啶),于室温反应18 h。抽滤，玻璃珠依次用二氯甲烷、甲醇、乙醚洗涤;置混合溶剂[10 mL,V(醋酐) ∶V(DMF)=1 ∶4]中，搅拌下反应1 h。抽滤，玻璃珠依次用二氯甲烷、甲醇、乙醚洗涤,烘干得7连接Fmoc保护甘氨酸(8)。

在反应瓶中加入8和混合溶剂30 mL[V(哌啶) ∶V(DMF)=1 ∶4],搅拌下于室温反应4 h(茚三酮检测玻璃珠不再显色)。依次用甲醇、二氯甲烷、乙醚洗涤，烘干得7连接甘氨酸(9)。

2 结果与讨论

按文献[8]方法测得1的氨基含量为8.9×10-3mmol·g-1。赵剑英等[11]在测定不同硅烷氨化试剂修饰玻璃表面后，测定的单层膜氨基密度约为2.1×1020个·m-2。1的氨基密度为2.2×1020个·m-2,与其它研究结果基本相当。

在1上连接侧链及氨基酸需要三步才能完成，中间步骤无法准确判断产率。脱去甘氨酸Fmoc保护后测定9的氨基含量为4.1×10-3mmol·g-1,由此计算产率为46.2%，实为三步的总产率，因此可以推断出每步平均产率为77.3%。

3 结论

1的表面功能基团为氨基，可以与多种基团反应，因此可连接不同基团，从而制备所需要的连接臂，满足不同的合成需求。低负载量的1可以适用于高分子量化合物的固相合成。

实验中采用的侧链类似于wang树脂侧链，氨基酸采用的是Fmoc保护策略。同样氨基酸也可以采用Boc保护策略，而侧链可以采用类似于Merrifield的侧链。在合成寡核酸时一般需要将CPG进一步衍生出氨基和引出合适的连接臂以便连接第一个核苷[12]。因此在玻璃珠进行氨基化之后，可以引入合适的连接臂，然后进行寡核酸的制备。

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