SCID小鼠腹腔内人B细胞非霍奇金淋巴瘤模型的建立

华映坤，曾 蓉，撒亚莲，赵仁彬，邹云莲，陆 洁，严新民，史克倩，沈晓梅

（云南省第一人民医院 临床基础医学研究所 血液科，云南 昆明650032）

B细胞淋巴瘤（B lymphoma）是源于滤泡生发中心的恶性肿瘤，复发及耐药是治疗失败的主要原因，寻找有效的诊治方法是当前的主要任务［1］。

建立荷瘤鼠模型对探讨肿瘤的病因、发病机制及制定诊治策略具有重要价值［2，3］。有学者已建立淋巴瘤模型［4，5］，为客观评估本实验室后续的研究结果，需建立自己的疾病模型数据。目前尚无SCID小鼠腹腔Namalwa细胞株－人B细胞淋巴瘤模型的报道。本研究通过在SCID小鼠腹腔接种Namalwa细胞，探索建立人B细胞淋巴瘤模型的条件及其肿瘤生长特性，观察荷瘤鼠的发病情况和生存时间，为研究B细胞淋巴瘤提供载体信息及搭建技术平台。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 Namalwa细胞株为本研究所冻存。

1.1.2 实验动物 SCID小鼠16只，雌性、雄性各半，4－5周龄，体重16－20g，购自北京维通利华实验动物有限责任公司。饲养和实验均在昆明医学院云南省天然药物重点实验室的SPF动物层流室内进行。

1.1.3 试剂和耗材 RPMI－1640购自 TakaRa公司。小牛血清购自Hyclone公司。免疫组织化学试剂购自福建迈新生物技术公司（一抗为鼠抗人的单克隆抗体）。流式标记CD19抗体购自BD公司。石蜡包埋切片及HE染色所用试剂为国产分析纯，塑料培养瓶、培养板均为Corning公司产品。

1.1.4 仪器 CO2培养箱（Forma Therapeutics Inc.，USA）；倒置显微镜（Nikon，Japan）；Shuang Lu冰箱 （BCD－230）；国产低速自动平衡离心机（LDZ 5－2）；流式细胞仪（Beckman－coulter EPICSXL，Immuno－Trul，USA）；SW－CJ－1F标准型型净化工作台（吴江市绿岛净化设备厂）；普通光学显微镜（重庆光学仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 Namalwa细胞系的培养及鉴定 迅速从液氮罐取出Namalwa细胞冻存管，放入38℃水浴中，不停摇动，使其快速融化，将细胞悬液转移到含培养液的离心管中，500g离心5min，弃上清，用含15%小牛血清（灭活补体）的RPMI－1640培养液重悬Namalwa细胞，置37℃，50ml／L CO2培养箱中培养。收集1×106细胞用流式细胞仪检测细胞膜表面分子CD19的表达。

1.2.2 人B细胞淋巴瘤SCID小鼠腹腔模型的建立 离心收集对数生长期的Namalwa细胞，用生理盐水悬浮细胞，每只小鼠经腹腔接种7.5×106个细胞（0.5ml）。

1.2.3 荷瘤鼠的发病情况及其脏器累及情况 观察荷瘤鼠的毛发、活动状态及肿瘤的生长情况。待荷瘤鼠自然死亡或濒死时处死并解剖观察脏器浸润情况，将瘤块及侵犯的脏器：肝、脾、胰、肾、肺、胃、肠、盆腔脏器、邻近的肌肉和皮肤等器官进行病理检查。

1.2.4 病理形态学检查 常规4μm厚的石蜡切片和HE染色法。

1.2.5 免疫组化 用MaxvisionTM 2试剂盒检测CD79a，CD20，Ki－67和 CD3在瘤组织中的表达，DAB显色。结果判断：CD79a，CD20和CD3以胞膜着色为阳性，Ki－67以胞核着色为阳性。

2 结果

2.1 Namalwa细胞形态及CD19的表达

Namalwa细胞体积中等，圆形，折光性强，以细胞克隆团和散在单个细胞相间存在；流式细胞术检测细胞膜表面表达CD19的阳性率为98.8%（图1）。

图1 Namalwa细胞的镜下形态及细胞膜表型

2.2 人B细胞淋巴瘤SCID小鼠腹腔模型的建立

16只SCID小鼠有14只成瘤，成瘤率87.5%，中位成瘤时间为（18.67±1.94）d，中位生存期为（28.00±6.36）d。腹腔接种Namalwa细胞株后5－7d，SCID小鼠头顶部出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓，活动减少，腹部包块，后期出现肿块处皮肤破溃，所在侧的后肢行走困难。一般情况随荷瘤时间的延长不断恶化。肿块大小为（1.5－3.0）cm×（0.5－1.5）cm（图2）。

2.3 病理学观察

荷瘤鼠腹部瘤块多为圆形或椭圆形结节，局部有坏死，边界尚清楚，有黏连。瘤体剖面呈灰白色，质细柔，鱼肉状，易碎。瘤细胞密集排列、均匀一致（部分标本瘤细胞相互粘连成片），呈现异型，间质极少。瘤细胞体积中等，胞浆少。胞核中等大，染色质较细致（有泡状），核仁较小，一个至数个，嗜碱性，核分裂活跃。许多瘤细胞发生碎屑性坏死。在肠、胃、肝、脾、肾、肺、胰、盆腔及邻近肌肉和皮肤有瘤细胞浸润，肝脏出现变性及局灶坏死（图3）。

图2 荷瘤的SCID小鼠和瘤组织

图3 瘤组织及瘤细胞浸润各组织的HE染色情况

2.4 瘤组织的免疫组织化学结果判断

CD79a在胞膜和Ki－67在胞核有弥漫的棕黄色阳性物质（图4－A，B）。CD20在胞膜有散在的棕黄色的阳性物质（图4－C）；CD3染色未见棕黄色的阳性物质（图4－D）。阴性对照未见棕黄色阳性物质。

3 讨论

制备小鼠肿瘤模型可选用免疫功能健全的小白鼠、细胞免疫功能缺陷的裸鼠及细胞免疫－体液免疫联合缺陷的SCID小鼠等［6］，本研究考虑到后续开展细胞过继免疫治疗的研究，为避免荷瘤鼠自身免疫的干扰，我们选用SCID小鼠制备淋巴瘤模型。瘤细胞常接种在皮下、腹腔或经血液播散成瘤。瘤体生长在皮下便于观察，但Hoyle等报道，淋巴瘤细胞株在小鼠皮下较难成瘤，需用Matrigel联合移植［7，8］。另外，淋巴瘤常在血管外以肿块为首发症状来就诊。鉴于此，本实验选用腹腔内成瘤。我们将7.5×106个Namalwa细胞经SCID小鼠腹腔接种后 （18.67±1.94）d，在腹腔出现包块，经病理观察及免疫组化检测B细胞淋巴瘤特征性抗原的结果提示，接种Namalwa细胞在SCID小鼠腹腔可以成功建立人B细胞淋巴瘤模型。在我们的实验中，雌、雄各有一只SCID小鼠未成瘤，可能与SCID小鼠存在Leaky现象（即：渗漏，在小鼠体内检测到淋巴样细胞和免疫球蛋白）有关［9］。

图4 免疫组化检测淋巴瘤组织中的特征性标记物

闫金松等将5×106及10×l06个Daudi细胞经SCID小鼠尾静脉移植建立淋巴瘤模型，观察到2周时出现竖毛、精神萎靡等变化，出现双下肢瘫痪的中位时间是30.5d（29－32d），存活时间是40d，而两个细胞浓度的发病时间、发病情况没有区别［5］。我们通过腹腔接种Namalwa细胞株后（5－7d）观察到竖毛，而腹腔出现包块的时间是（18.67±1.94）d，存活时间为（28.00±6.36）d。上述结果的不一致可能与接种瘤细胞的途径及细胞株类型不同有关。

我们观察到接种Namalwa细胞后，荷瘤鼠的瘤体生长速度快，且累及多个脏器及组织，在肝、脾、胰、肾、肺、胃、肠、盆腔脏器、邻近的肌肉和皮肤等有瘤细胞的广泛浸润。Namalwa细胞株来自B细胞淋巴瘤患者。用免疫组化的方法检测到瘤组织表达B细胞特征性标记物CD79a为强阳性，CD20为散在分布（与CD79a抗原表达谱较CD20广有关），而T细胞标记物CD3为阴性。Ki－67是 一种与细胞周期相关的蛋白质，为细胞增殖及DNA合成所必需，是反映细胞增生活性的指标。Ki－67在瘤组织中为弥漫阳性，提示肿瘤细胞增生活跃［10，11］。我们的结果表明在SCID小鼠腹腔成功建立了Namalwa细胞源的人B细胞淋巴瘤模型，这为我们开展后续研究提供载体。

致谢：感谢本院病理科陈天星主任医师、杨慧主管技师、李英技师、杨宣涛副主任医师、张会华主管技师的支持和帮助！

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［4］Bertolini F，Fusetti L，Mancuso P，et al.Endostatin，an antiangiogenic drug，induces tumor stabilization after chemotherapy or anti－CD20therapy in a NOD／SCID mouse model of human highgrade non－Hodgkin lymphoma［J］.Blood，2000，96（1）：282.

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