测量小鼠眼内压实验动物模型的建立

刘海鹏，宋忆淑，邵 英，张 舵＊

（1.吉林大学第一医院 整形外科，吉林 长春130021；2.吉林大学第二医院 眼科，吉林 长春130041）

随着功能基因组学研究的深入，在活体动物模型上验证基因的生理功能，有十分重要的意义。活体小鼠眼内压测量及相关房水动力学实验模型的建立始终是眼科领域最为困难的课题之一，测量分析小鼠眼房水静态和动态生理学特性，该项研究工作极具挑战性，以往很少有人涉足，如能建立一种精确性高、稳定性和可重复性好的小鼠眼内压测量系统将可能为致盲率最高的眼科疾病青光眼的治疗带来希望［1］。为此，本研究中我们采用纤维玻璃管侵入方法，利用将液体的压力变化经传感器在电子计算机中转变成数字信号的实验原理，成功建立了独特的活体小鼠眼内压测量模型和与之相匹配的测量精度检验校正系统。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

显微操作用玻璃管、硬硅胶管、眼科显微手术器械、水柱压力计；克他命（Ketamine）、甲苯噻嗪（Xylazine）、0.5%丙美卡因（Proparacaine）、垂直型玻璃拉管机（Model 700C，David Kopf Instruments）、水平显微热加工机（Microforge，Model MF900，Narishige Co.Japan）、旋转式显微磨光机 （Model BV10，Sutter Instruments Co.）、手术显微镜（Zeiss）、压力传感器（MX860，Medex Inc.）、电脑检测系统的硬件和软件（Model MP100，Biopac）、玻璃显微注射器（10μl，Hamilton）、自动注射泵（Harvard Apparatus），4－轴显微操作仪（Narishige）、电离子渗透仪、Z－轴扫描共聚焦显微镜（改装）。

1.2 实验动物

4种 CD1小鼠：wildtype；AQP1－／－；AQP4－／－；AQP1－／－＋AQP4－／－，每种10只，雌雄各半，年龄为4－6周（重量27－33克），由美国加州大学旧金山医学院动物室提供，用含有4%脂肪的标准鼠食，室内灯光为12h光照／12h黑暗周期循环，整个实验过程完全符合实验动物应用法规。

1.3 眼内压测量系统的建立和调试

利用将液体的压力变化经传感器在电子计算机中转变成数字信号的实验原理，建立眼内压测量系统，如图1。该系统可选择性连接一只玻璃显微注射器，由自动注射泵控制注入速度。测量系统的连接管各连接处紧密连接，确保无渗漏，细致检查排出系统液体中的任何微小气泡。验证测量系统无渗漏：向测量系统内注入液体，使压力升至60 cmH2O，停止注入液体，12h后压力仍保持在60 cmH2O无下降，证明该测量系统无渗漏；验证测量系统的精确性：先常规校正电脑检测系统，然后在大气压下，将显微玻璃管尖置于水滴中，此时大气压力测量值为零，将管尖刺入与水柱压力计相连的胶皮囊，可获得水柱压力值，计算机记录的测量结果与水柱压力计数值相同，当水柱压力改变时，微机记录显示出相同的改变，证明测量系统准确无误，如图2。

1.4 实验小鼠准备

小鼠首先用克他命（100mg／kg）和甲苯噻嗪（9 mg／kg）混合腹腔内注射麻醉。角膜用0.5%丙美卡因（Proparacaine）滴眼表面麻醉。麻醉生效后，将小鼠固定于立体固定器，并置于加热垫上。用肛门体温探测器测量体温，使小鼠体温维持在37±1℃。鼠眼暴露于手术显微镜下，间断点滴生理盐水预防角膜干燥，如图3。

1.5 眼内压模型的建立

在小鼠角膜上滴一滴生理盐水，调节4－轴显微操作仪，使显微玻璃管与眼球垂直轴成45－60°角，当管尖进入角膜表面盐水中时，计算机开始测量记录，将此时测量的大气压力设定为0cmH2O。在40倍手术显微镜下，左手持小镊子轻轻固定眼球中后部，右手调节显微控制器，在位于角膜正中央外侧约0.2mm处，用玻璃管尖快速刺穿角膜，控制管尖恰好位于前房间隙中，不能触及晶体囊膜及虹膜。将最初10－30秒钟内眼内压记录的平均值，视为该鼠的生理眼内压的数值。测量过程中保持角膜上的液滴，预防角膜干燥。

1.6 观察指标 ①小鼠眼内压测量系统精确性验证：（1）为确认管尖无阻塞并测量到前房的真实压力，在实验中将第2支显微玻璃管同时刺入前房中，并同一个水压力计相连，如（图1，左侧灰线部分），用来验证是否测量到前房的真正压力，当改变水压力计设定的压力时，计算机可精确记录到相应变化。（2）连续测量眼内压30min以上，获得稳定眼内压，证明测量系统精确稳定无渗漏。（3）分别测量同一只小鼠双眼的眼内压，双眼检测结果相符，进一步证明测量系统是可靠的。②利用建立的眼内压测量系统测量40只不同基因型小鼠的眼内压。

图1 眼内压测量系统工作原理示意图

图2 小鼠眼房水动力学检测系统精确性校正

图3 小鼠眼房水动力学测量 显微操作

2 结果

2.1 小鼠眼内压测量系统精确性评价

为确认管尖无阻塞并测量到前房的真实压力，第2支显微玻璃管同时刺入前房中，并同一个水压力计相连，先将压力计压力定为0cmH2O，后每间隔一分钟左右，调节压力计依次升高5cmH2O，压力依次改变为0－5－10－15－20－25－30 cmH2O；再调节压力计依次下降5cmH2O，压力依次改变为：30－25－20－15－10－5－0cmH2O。此时测量系统可精确记录到相应压力变化，证明测量系统的精确和可信，如图4。连续测量眼内压30 min以上，获得稳定眼内压，证明测量系统精确稳定无渗漏，如图5。分别测量同一只小鼠双眼的眼内压，双眼检测结果相符，进一步证明测量系统是可靠的，如图6。

2.2 小鼠眼内压测量结果

在实验中连续记录了40只小鼠眼内压的生理曲线，曲线平稳不变，如图7。

图4 验证测量系统精确性压力曲线

图5 小鼠眼内压连续测量记录稳定性曲线

图6 小鼠双眼眼内压测量 曲线

图7 CD1（wildtype；AQP1－／－；AQP4－／－；AQP1－／－＋AQP4－／－）小鼠眼内压测量曲线

3 讨论

目前，世界上关于小鼠眼生理指标和特性的研究资料甚少，最主要原因是动物模型建立难度大、精度要求高。小鼠眼生理测量系统的建立和调试过程是艰难和复杂的，手工操作步骤及其影响因素过多，存在着诸多系统误差和人为误差。这也给活体小鼠眼内压测量及相关房水动力学研究带来了很大困难。

以往世界上仅有3个实验室能够测量到小鼠眼内压，然而这3个实验室所采用的测量方法完全不同，因此获得的数据自然也缺少可信性［2－3］。Jone等人的方法最初所测得的小鼠眼内压数值偏低［4－9］，且前后波动过大。Cohan等人的非入侵法，测得的眼内压值也相对较低，误差较大。Avila［10］等提出的SNMS方法，虽然测量到与其它方法相比相对较高，看似相对合理的眼内压值，但这可能与单独用克他命麻醉剂使眼内压升高有关。

本研究中，我们以医学和生物物理学的理论为依据，凭借多年积累的显微操作实践经验，精心设计并建立了独特的小鼠眼内压测量系统和与之匹配的测量精度检验校正系统。我们着重解决了实验操作过程中所涉及的各种影响因素，通过将50μm的玻璃管尖刺入前房中，能记录到瞬时眼内压的变化情况；能在无房水渗漏的情况下，连续测量30分钟以上眼内压的动态变化；并能将液体注入房水间隙，同时测量房水排出、房水间隙的顺应性等其它重要眼生理学指标，因此是一种精确、稳定的多功能小鼠眼内压测量方法。

［1］Nissirios N，Goldblum D，Rohrer K，et al.Noninvasive Determination of Intraocular Pressure（IOP）in Nonsedated Mice of 5Different Inbred Strains［J］.Glaucoma，2007，16（1）：57.

［2］Avila MY，CarréDA，Stone RA，et al.Reliable measurement of mouse intraocular pressure by a servo－null micropipette system［J］.Invest Ophthal Vis Sci，2001，42：1841.

［3］Savinova OV，Sugiyama F，Martin JE，et al.Intraocular pressure in genetically distinct mice：an update and strain survey［J］.BMC Genet，2001，2：12.

［4］John SWM，JR Hagaman，TE MacTaggart，et al.Intraocular pressure in inbred mouse strains.Invest［J］.Opthalmol Vis Sci，1997，38：249.

［5］Cohan BE，Bohr DF.Measurement of intraocular pressure in awake mice［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42：2560.

［6］Ahmed E，Ma J，Rigas I，et al.Non－invasive tonometry in the mouse.Invest［J］.Ophthalmol Vis Sci，2003，44：E.

［7］Danias J，Kontiola AI，Filippopoulos T，et al.Method for the noninvasive measurement of intraocular pressure in mice［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44：1138.

［8］Reitsamer HA，Kiel JW，Harrison JM，et al.Tonopen measurement of intraocular pressure in mice［J］.Exp Eye Res，2004，78：799.

［9］Ji J，Chang P，Pennesi ME，et al.Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells［J］.Vis Res，2005，45：169.

［10］Avila MY，CarréDA，Stone RA，et al.Reliable measurement of mouse intraocular pressure by a servo－null micropipette system.Invest［J］.Ophthal Vis Sci，2007，42：1841.