Rac1和Cdc42在鼻咽癌组织中的表达及预后相关性研究

齐 岩，黄 波，司晋源，张名霞，张秋航＊

（1.首都医科大学宣武医院 耳鼻咽喉头颈外科，北京100053；2.广西壮族自治区人民医院 鼻咽癌研究所）

近年来的研究显示小G蛋白可能是细胞信号转导的关键环节。有学者发现Rac1和Cdc42的定位随着细胞不断移动而发生改变，提示了Rac1和Cdc42与肿瘤细胞的转移可能相关。Itoh等研究指出Rac1具有调节细胞骨架、片层伪足和细胞膜皱褶形成的功能，而这些改变是肿瘤细胞发生侵袭和转移的早期事件[1]。本研究通过观察鼻咽癌组织中Rac1及Cdc42的表达，探讨Rac1和Cdc42信号分子可能参与鼻咽癌侵袭转移过程的机制，本实验采用免疫组织化学S－P法检测鼻咽癌标本肿瘤组织与鼻咽正常上皮组织中Rac1和Cdc42的表达，并探讨其表达与临床指标的关系，以及各分子标志物之间的相互关系及其在鼻咽癌侵袭转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 所有组织标本均来自2003年9月至2004年9月于广西壮族自治区人民医院耳鼻喉头颈外科二区门诊就诊的病人，共102例，所有患者初诊时经病理组织学检查确诊。按1991年WHO分类法分为低分化鳞癌和未分化非角化型癌。均未经治疗。20例对照组为门诊要求体检的正常人群鼻咽部活检组织，病理诊断均鼻咽正常上皮组织。经广西壮族自治区人民医院伦理委员会通过，所有参与实验的患者均签署知情同意书。组织标本活检后生理盐水冲洗洁净，置于10%中性福尔马林液中固定用于免疫组化。

全部患者治疗后第一年内每隔3个月、第2－3年每隔6个月、3年以后每年复查一次；随访包括鼻内镜、胸片、B超、CT、MRI等相关检查。采用门诊复查、信访或电话随访，全部患者至少随访5年以上，末次随访时间为2009年3月，其中4例失访，随访率为96.1%，失访者按死亡处理。获得患者的临床资料包括病史、体格检查、病理检查、CT、骨扫描、超声检查、MRI检查以确定其临床分期。102例患者中，男性患者76例，女性26例，年龄在20到84岁之间。根据1998年AJCC标准，Ⅱ期患者25例，Ⅲ期患者58例，Ⅳ期患者19例，详见表3。

102例鼻咽癌患者均予以根治性放疗，Ⅲ期和Ⅳ期患者联合化疗（MEPFL方案）。采用6MV－X线常规分割照射，每次DT2Gy，每天一次，每周5次。鼻咽部原发病灶设双侧面颈联合野，放疗至DT34－40Gy后缩野改为耳前野继续外照射至DT60－70Gy，6－8周完成。颈部设颈前切线野，无颈淋巴结转移灶则外照射至DT50Gy，5周完成，有颈淋巴结转移灶则外照射至DT60－70Gy，6－8周完成。脊髓和脑干剂量控制在以40Gy以下。

1.2 检测方法 采用免疫组化SP法检测，抗体为Rac1鼠抗人单克隆抗体（Abcam公司ab－33186美国）和CDC42鼠抗人单克隆抗体（Santa CruzSC－872美国）。免疫组化结果判断标准参照陈丰霖等的方法：采用双盲法，观察切片至少5个以上具有代表性的高倍视野，不少于1000个细胞，对免疫组化结果进行评估[2]。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.0分析软件，免疫组化的数据采用χ2检验及四格表确切概率法。相关性Spearman等级相关分析。

生存时间按月计算。主要应用了Kaplan－Meier统计方法，将Rac1和Cdc42免疫组化蛋白表达的量值按（－）和（＋）为低表达组，（＋＋）和（＋＋＋）为高表达组进行分组，分别计算了总生存概率及无瘤生存率。组间比较应用了Log－rank方法进行显著性检验及趋势检验。P＜0.05具有显著的统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色显示 SP法免疫组化切片染色背景清晰，阴性对照无着色。Rac1阳性反应，主要存在于细胞浆和细胞核中，呈棕黄色颗粒。Cdc42阳性反应主要存在于细胞浆，呈棕黄色，见图1。

2.2 102例鼻咽癌中，Rac1阳性表达86例（84%），染色呈棕褐色弥漫性分布。阴性表达16例（16%），28例（27%）弱阳性表达，58例（57%）强阳性表达。而Cdc42阳性表达83例（81%），染色呈棕褐色弥漫性分布。阴性表达19例（19%），25例（25%）弱阳性表达，58例（57%）强阳性表达，见表1、2，图1。

图1 Rac1和Cdc42在鼻咽癌组织及鼻咽部正常上皮组织中中的表达

表1 鼻咽癌组织和鼻咽部正常上皮组织中Rac1的表达

表2 鼻咽癌组织和鼻咽部正常上皮组织中Cdc42的表达

2.3 分析发现Rac1和Cdc42表达鼻咽癌与对照组相比有显著差异，对照组Rac1和Cdc42表达均显著低于鼻咽癌组，两者差异有统计学意义（P＝0.004；P＝0.016）。

2.4 鼻咽癌中Rac1和Cdc42表达与临床病理的关系 表3结合患者的临床资料，反映Racl和Cdc42表达率的临床意义。我们看到Rac1和Cdc42表达率与患者的年龄、性别均无关，而在分化程度、浸润深度和TNM分期等临床病理指标之间的差异比较则显示统计学意义非常显著。

表3 鼻咽癌中Rac1和Cdc42表达与临床病理的关系

2.5 鼻咽癌Racl和Cdc42表达水平与临床TNM分期的关系 TNM分期是临床指示肿瘤严重程度的量化指标。分析Racl和Cdc42阳性表达的癌组织不同TNM分期的Rac1和Cdc42表达水平，可以发现Rac1和Cdc42表达水平在各分期之间存在明显的差异，见表4、5。

表4 鼻咽癌组织中Rac1的表达水平与TNM分期的关系

2.6 鼻咽癌组织中Rac1和Cdc42表达的相关性为了进一步分析鼻咽癌组织中Rac1和Cdc42表达的关系，我们将免疫组化的数据进行了Spearson相关分析。分析其在鼻咽癌组织中的表达强度的关系，我们观察到Rac1和Cdc42之间存在相关关系（P＜0.05），见表6。

2.7 经Kaplan－Meier计算总生存率平均为61.9±23.0，平均随访时间为60个月。病人的随访时间为12－87个月。102例患者中30例患者死于鼻咽癌。其生存时间的范围是3－67个月。在图2（a－d）中可以看到经Kaplan－Meier计算的Rac1和Cdc42的生存率曲线。在Rac1低表达组和高表达组中，其5年总生存率和无瘤生存率分别为88.64% 和86.36比44.83和34.48%。（χ2＝27.236，P＜0.001；χ2＝28.836，P＜0.001）。但是，Cdc42 低 表达组 和Cdc42高表达组，5年生存率的差异无统计学意义（χ2＝0.822，P＝0.364）。在这两组中，无瘤生存率的差异也同样无统计学意义（χ2＝0.289，P＝0.591）。

表5 鼻咽癌组织中Cdc42的表达水平与TNM分期的关系

表6 鼻咽癌组织中Cdc42和Rac1表达的关系

图2 Kaplan－Meier计算的Rac1和Cdc42的生存率曲线

3 讨论

近年来的研究结果显示Rac1在人类的正常组织中呈现低水平表达或不表达，但在卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤组织或细胞中表达增高，而且Rac1的高表达同肿瘤细胞的分化程度、病理分型、TNM 分 期等表 型密切 相关[3－9]。以往有关Cdc42同恶性肿瘤的相关性研究有以下几个方面，Cdc42在肺部腺癌中的表达明显高于腺瘤，提示其可能与肺部肿瘤的进展有关[10]。Hirsch等报道Cdc42的负显性突变体同大鼠乳腺癌细胞侵袭和转移相关[11]。在2002年的Oncogene中，Meriane等指出Cdc42和Rac1与平滑肌肉瘤的恶性表型密切相关[12]。

本论文以免疫组化SP法检测鼻咽癌组织和鼻咽部正常上皮组织中Racl和Cdc42的表达，证明在不同组织中Racl和Cdc42表达不同：鼻咽癌组织中Racl和Cdc42表达阳性率为84%和81%，而鼻咽部正常上皮组织表达阳性率为25%和35%。癌组织Racl和Cdc42的阳性率远高于鼻咽部正常上皮组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。在临床TNM分期上Racl和Cdc42表达不同：TNM分期越高，则Racl和Cdc42表达率也越高。从病理角度看：分化程度的相关性最大，低分化癌阳性率高达91.1%和87.8%，而高中度分化患者阳性率只有33.3%，两组之间的差异非常明显。可见，Racl和Cdc42的表达与鼻咽癌病情密切相关：病情越重、分化程度越低，Racl和Cdc42表达率越高。

一般认为，鼻咽癌的预后与病理类型、TNM分期等因素相关。但我们在临床中常常见到相同分期的病人却有种截然不同的预后病程。近年来一些实验研究证实，有些分子标志物也被证实为有意义的预后预测因子，这些因子有些已被作为预后判断的指标，与治疗方案结合，作为辅助治疗的选择依据。

关于鼻咽癌的预后的分子标志物的研究近年来成为热点，其中血浆EBV－DNA水平的相关研究较多，但目前大规模人群筛查指标的研究目前还难以推广。本研究通过多因素分析，发现肿瘤的临床分期与鼻咽癌患者预后有显著相关性，是影响患者总体生存率和无瘤生存率的独立因素。目前对鼻咽癌肿瘤相关标志物的研究尚处于探索性阶段，鼻咽癌的生物标志物检查将帮助我们进一步从分子生物学的角度观察和解释癌的临床转归。然而，如何有机地综合这些信息，对个体进行准确的预后预测，指导个体化治疗方案的选择，并最终改善预后，还需进行更深入的研究和长期的努力。

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