肿瘤干细胞标记物LGR5和CD133在卵巢癌中的表达和意义

翟颖仙，张丽红，周 莉，王医术＊

（1.吉林大学 病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春130021；2.吉林大学基础医学院 组织学与胚胎学系，吉林 长春130021）

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，由于缺乏有效的早期诊断方法，以及肿瘤的高复发率和复发后高耐药性，其疗效并不理想。因而早期诊断及如何解决卵巢癌的复发和耐药性问题，成为提高卵巢癌患者存活率的关键。

肿瘤干细胞（Cancer Stem Cell，CSC）具有无限增殖潜能，对肿瘤的发生、发展和转移起决定性作用，也是肿瘤复发、转移和治疗失败的根源。而卵巢癌干细胞的表面标记物的选择，则成为早期诊断及攻克肿瘤的前提。目前关于卵巢癌干细胞的研究较少，尚未发现特异性的卵巢癌干细胞标志物。由于CSC与正常干细胞具有相似的表面标志，因此CSC标志物的筛选可参考正常干细胞标志物，如CD133等。而Lgr5与结肠癌等原发性肿瘤之间存在着密切联系，有可能成为今后临床肿瘤靶向治疗的关键点。

本研究通过以33例卵巢浆液性乳头状腺癌为研究对象，以6例相对正常卵巢组织，6例卵巢浆液性囊腺瘤作为对照，通过免疫组织化学方法观察干细胞标记物Lgr5和CD133的表达情况，并探讨二者表达的相关性，为以肿瘤干细胞为靶向治疗卵巢癌提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验组织标本来源 标本来源于吉林大学第一临床医院2008年7月—2009年12月期间的卵巢切除标本，共计45例。包括：相对正常卵巢组织6例；卵巢浆液性囊腺瘤6例；卵巢浆液性乳头状腺癌33例。所有患者术前均未接受任何化疗、放疗等的辅助治疗，临床病例资料完整。

1.2 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色采用SP法。

1.3 结果判定 高倍镜下（200×）每张切片随机选择5个视野，正常卵巢组织计数卵巢表面上皮细胞，卵巢浆液性囊腺瘤和卵巢浆液性乳头状腺癌计数肿瘤细胞，每个视野计数200个细胞，共1000个，计算阳性细胞所占的百分数，按如下分级：＞50%为＋＋＋（阳性）；25%－50%为＋＋；＜25%为＋；无着色为 －（阴性）。

1.4 统计学方法 全部实验数据用SPSS17.0统计软件分析处理。各组间数据分别采用χ2检验，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 Lgr5在正常卵巢、浆液性囊腺瘤和浆液性乳头状腺癌中的表达 Lgr5主要表达于细胞质中，呈棕黄色颗状。Lgr5蛋白在正常卵巢组织中的阳性表达率为33.3%（2／6），且均为弱阳性表达；在卵巢浆液性囊腺瘤中阳性表达率也为33.3%（2／6），与正常卵巢组织相比无差异（P＞0.05）。在卵巢浆液性乳头状腺癌组织中，Lgr5阳性表达率为78.7%（26／33），与正常卵巢组织和浆液性囊腺瘤相比，有显著性差异（P＜0.05）。且随着肿瘤分化程度的不同，从高分化到低分化，Lgr5阳性表达率逐渐提高（见表1，图1）。

表1 Lgr5蛋白在正常卵巢、浆液性囊腺瘤和浆液性乳头状腺癌中的表达

图1 Lgr5在不同分化程度的卵巢浆液性乳头状腺癌组织中的表达（400×）

2.2 CD133在正常卵巢、浆液性囊腺瘤和浆液性乳头状腺癌中的表达 CD133主要表达在细胞质中，呈棕黄色颗粒。CD133在正常卵巢组织中阳性表达率为33.3%（2／6），且为弱阳性表达。在浆液性囊腺瘤中阳性表达率为50%（3／6），与正常卵巢组织相比有显著差异（P＜0.05），但依然为弱阳性表达。CD133在浆液性乳头状腺癌中阳性表达率为57.5%（19／33），与正常卵巢组织相比有显著差异（P＜0.05），但与浆液性囊腺瘤无差异（P＞0.05）。随着肿瘤分化程度的不同，从高分化到低分化，CD133阳性表达率逐渐增高（见表2，图2）。

表2 CD133蛋白在正常卵巢、浆液性囊腺瘤和浆液性乳头状腺癌中的表达

图2 CD133在不同分化程度的卵巢浆液性乳头状腺癌组织中表达（400×）

2.3 卵巢癌中Lgr5和CD133表达相关性 33例卵巢癌标本中，分析Lgr5蛋白与CD133蛋白表达水平发现，两者均为阴性表达6例，均为阳性表达18例，Lgr5＋CD133－有8例，Lgr5－CD133＋有1例。Lgr5和CD133在卵巢癌中表达呈正相关，差异有统计学意义，r＝0.71，P＜0.01。

Lg CD133 r5﹣合计＋ ＋＋ ＋＋＋6 8 0 0 14＋ 1 5 7 0 13＋＋ 0 1 2 2 5＋＋＋ 0 0 0 1 1合计﹣7 14 9 3 33

3 讨论

卵巢癌是女性高发的恶性肿瘤之一。由于缺乏有效的早期诊断方法，其5年生存率较低。近年来，随着肿瘤干细胞学说的兴起，卵巢癌干细胞学说为卵巢癌的诊断和治疗提供了新的靶点。

然而，由于肿瘤干细胞膜蛋白表达谱的异常，以及在卵巢癌中正常干细胞表型相关信息的缺乏，人们只能依赖于筛查已知的与卵巢表面上皮干细胞相关的干细胞标记物来分离鉴定卵巢癌干细胞。目前，了解较多的有 CD133，Lgr5，CD44、CD117和CD44／MYD88。本实验选取其中的Lgr5和CD133作为肿瘤干细胞标记物，观察它们在卵巢浆液性乳头状腺癌中的表达情况。

富含亮氨酸重复序列G－蛋白偶联受体5（Lgr5），又 名 GPR49、HG38、FEX、GPR67 和MGC117008，是由18个富含亮氨酸的重复单位和7个跨膜区域组成的大分子蛋白，是G－蛋白偶联受体家族的成员之一[1]。Wnt信号转导通路是调控人体胚胎发育和生长的重要通路，Lgr5作为 Wnt信号通路中β联蛋白TCF－4的靶基因，其表达的上调或下调，可能在细胞的增殖、分化和肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。因而，Lgr5蛋白也被认为是受Wnt信号途径调节的靶基因之一。许多研究也证实Lgr5在多种肿瘤细胞中高表达，如胃癌，结肠癌以及皮肤基底细胞癌等[2－4]。

本实验通过免疫组织化学方法，观察Lgr5在正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤和卵巢浆液性乳头状腺癌中的表达情况。结果显示，正常卵巢组织中，Lgr5在上皮、卵泡细胞，血管壁和间质呈弱阳性表达，主要表达在细胞质中，呈棕黄色颗粒，阳性表达率为33.3%；卵巢浆液性囊腺瘤中，Lgr5表达于瘤细胞胞质中，阳性表达率为33.3%，与正常卵巢组织相比无差异性（P＞0.05）。卵巢浆液性乳头状腺癌中，Lgr5阳性表达在癌细胞胞质中，阳性表达率为78.7%，但表达表现不均一，即同一视野中，部分癌细胞呈强阳性表达，其中强阳性表达3例，与正常卵巢组织和浆液性囊腺瘤相比，均有显著性差异（P＜0.05）。仔细观察发现Lgr5在肿瘤中随着肿瘤分化程度的不同，从高分化到低分化，Lgr5阳性表达率逐渐提高。此结果提示我们随着肿瘤恶性程度的进展，Lgr5蛋白水平表达增高，说明Lgr5蛋白与肿瘤的发生进展有关，可能有助于卵巢癌的筛选和恶性程度的判定。

跨膜糖蛋白CD133是目前用于各种肿瘤干细胞研究的热点标志物之一。目前我们已经知道，CD133可表达于造血定向干细胞、上皮干细胞，和包括脑、前列腺、胰腺、肝脏、皮肤、卵巢、结肠等组织在内的肿瘤干细胞[5－7]。CD133的表达与上皮性肿瘤密切相关，是干细胞和肿瘤干细胞表面特异性标记物。研究显示，CD133可以作为脑肿瘤干细胞标记物，脑肿瘤中CD133阳性细胞具有很强的增殖、自我更新和分化能力；胰腺癌中CD133侧群细胞具有更强的致瘤性，很可能是胰腺癌干细胞表面特异分子标记。同时CD133也是卵巢癌中研究的最多的标记物。报道显示，CD133－1和CD133－2均可表达于卵巢癌中，而在正常卵巢组织，良性肿瘤和转移癌中则未见表达[8]。CD133阳性卵巢癌细胞比CD133阴性细胞具有更高的增殖能力和克隆形成能力。此后，又有研究发现卵巢肿瘤中的CD133阳性细胞具有成瘤性，并进一步证实CD133的调节异常与肿瘤的恶性转化相关。CD133阳性细胞具有自我更新能力，并与异种移植肿瘤侵袭性增加有关。因而，CD133可能是卵巢癌干细胞的标记物。

本研究显示，在正常卵巢组织中，CD133阳性表达在细胞核或细胞质中，呈棕黄色颗粒，为弱阳性表达，阳性表达率为33.3%。在卵巢浆液性囊腺瘤中，CD133在瘤细胞胞质中弱阳性表达，阳性表达率为50%，与正常卵巢组织相比，有显著差异（P＜0.05）。卵巢浆液性乳头状腺癌中，CD133阳性表达在癌细胞胞核或胞浆中，阳性表达率为57.5%，且在癌巢基地部位强阳性表达，与正常卵巢组织相比有显著差异（P＜0.05），但与浆液性囊腺瘤相比无差异（P＞0.05）。仔细观察发现随着肿瘤分化程度的不同，从高分化到低分化，CD133阳性表达率逐渐增高。随着肿瘤恶性程度的进展，CD133蛋白水平表达增高，与肿瘤的发生进展有关。癌巢基底部位强阳性表达则提示我们，CD133阳性细胞可能参与侵袭过程。检测CD133在卵巢癌不同病理阶段的表达，可能有助于卵巢癌的诊断及病程进展的判定。

本研究结果提示Lgr5与CD133表达呈正相关，即Lgr5亦可作为卵巢癌干细胞的备选标记物，与CD133一样与卵巢癌的发生发展有重要关联。至今为止，未见Lgr5和CD133在卵巢癌中表达相关性的报道。

综上所述，本研究的结果表明Lgr5和CD133可能作为卵巢浆液性乳头状腺癌干细胞的表面标记物，为卵巢癌恶性程度的判定和治疗提供新的靶点。

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