初步探讨口腔鳞状细胞癌中的p33／ING1表达的意义

王晓峰，张天夫，王 伟，刘 新

（吉林大学中日联谊医院 口腔科，吉林 长春130033）

通过人们长期对癌基因和抑癌基因的研究结果表明，从本质上来说，肿瘤是一种多基因病，其中抑癌基因可能是阻止肿瘤发生的一种保护机制。近年在对口腔鳞癌的研究中发现一种新抑癌基因ING1，它与p53关系密切，有协同作用。为了探讨ING1与口腔鳞状细胞癌发生发展的关系，本研究采用体外细胞培养，间接免疫荧光等技术观察p33／ING1的表达情况，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

30例正常组织取自智齿拔除术和唇裂手术切除等新鲜标本，均经病理证实无异常增生改变；30例异常增生组织取自吉林大学中日联谊医院口腔科口腔鳞癌手术切除新鲜标本，原发灶，患者未经放、化疗治疗，取材范围参考口腔肿瘤常规手术标准，距肉眼可见癌组织0.5－1.0cm之间，并经病理切片证实有异常增生而没有癌变的组织；口腔鳞状细胞癌组织取自我院收治的30例口腔鳞状细胞癌患者，经病理证实有癌变。

1.2 实验方法

1.2.1 口腔黏膜上皮细胞原代培养 无菌条件下所取的口腔黏膜组织立即保存于无菌液中，经过处理后制成细胞悬液，接种于12孔培养静置培养，当细胞长至培养板的80%时开始传代，以1∶2或1∶3的比例接种于培养板中继续培养。传代后培养12h，待细胞长至80∶90%进行细胞铺片，用于免疫荧光。

1.2.2 免疫细胞化学检测方法 取第二代细胞制细胞爬片，PBS洗涤3次后，4%的多聚甲醛溶液固定30min，0.1%Trtion－100（pH＝7.2）室温下处理10min。用广谱单克隆角蛋白抗体及SP免疫组化试剂盒按试剂盒说明书进行操作。

1.3 观察指标

激光共聚焦荧光显微镜下观察，p33／ING1阳性细胞为胞核及胞膜上出现翠绿色的颗粒，密度均匀、致密。随机选择10个视野，对p33／ING1阳性细胞数进行计数，由此得出阳性细胞的百分比。荧光染色结果做如下分类：＞50%为“＋＋”，10%－50%为“＋”，＜10%为“－”。分析时 “＋”、“＋＋”归为阳性表达；“－”归为低表达或不表达。

1.4 统计学方法

检测结果用SPSS11.00软件进行统计学分析，各组的p33／ING1阳性细胞百分率进行计数资料的χ2检验，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

30例NOK和30例DOK中p33／ING1蛋白表达多为阳性表达且多为“＋＋”（见图1，图2），阳性率为100%及93.3%；30例OSCC中p33／ING1蛋白多为低表达或不表达（“＋”或“－”）（见图3），阳性率26.7%，两者存在显著性差异，有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1 NOK中P33／ING1强阳性表达（×200）

图2 DOK中P33／ING1阳性表达（×200）

图3 OSCC中P33／ING1低表达（×200）

表1 p33／ING1在NOK、DOK和OSCC中表达的情况

3 讨论

Garkavtsev等在1996年研究发现了一个新的抑癌基因ING1，命名为p33／ING1。该蛋白与多种恶性肿瘤的发生和发展关系密切，近年来已在人体多种肿瘤（乳腺癌、胃癌和头颈部鳞癌等）中发现p33／ING1的突变。口腔鳞状细胞癌是最常见的口腔恶性肿瘤，发病率高，生存质量差。目前研究表明，口腔鳞癌的发生发展是一个多基因多因素相互作用的过程，其中抑癌基因的失活、缺失在导致肿瘤发生发展过程中发挥着举足轻重的作用。在口腔鳞癌中，多数研究发现p33／ING1与p53之间有协同作用[1－3]。

本研究应用细胞原代培养方法及间接免疫荧光技术检测p33／ING1在口腔鳞癌发生发展中的表达。研究发现，NOK和DOK细胞中均可检测到p33／ING1蛋白的表达，其表达主要定位于胞核及胞膜上，其中NOK细胞中p33／ING1染色尤以胞核中更强，偶见于胞浆；OSCC细胞中p33／ING1抗体染色微弱，主要分布于胞浆。ING在NOK细胞中p33／ING1基因的表达要远远高于在OSCC细胞中的表达，有显著差异，有统计学意义（P＜0.05），因此我们推测p33／ING1的低表达或不表达可能与口腔鳞癌的发生发展有关，可作为口腔鳞癌早期发现和诊断的一种生物学指标。另有学者研究发现[4，5]，p33／ING1蛋白的阳性表达和胃癌分化程度具有相关性，分化越低，其阳性表达率越低。p33／ING1蛋白与口腔鳞状细胞癌之间是否也有这种相关性，仍需进一步的研究。此外，p33／ING1蛋白在OSCC细胞中的低表达是否是由于其它抑癌基因的启动而抑制了p33／ING1基因的表达，也需要进一步的研究证明。

总之，p33／ING1在口腔鳞癌的发生发展中可能起着一定的作用，为判断口腔黏膜上皮癌变过程及阻断、治疗提供新思路。但是肿瘤的发生是多基因多因素共同作用的结果，p33／ING1基因的表达是否与其他抑癌基因、癌基因和凋亡相关基因等有关系[6]，还有待进一步研究。

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