乙肝病毒外膜大蛋白、前S1抗原、HBV－DNA与血清标志物之间相关性分析

龚 杰，刘柏林，方艳秋＊，杨广民

（1.厦门大学医院 体检科，福建 厦门361005；2.吉林省人民医院，长春130021）

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种传染性疾病，可进一步发展为肝硬化甚至肝癌，晚期导致患者肝功能衰竭，严重影响患者的健康。早期对HBV感染进行明确诊断，做出相应防治措施，对提高临床疗效和改善患者预后具有重要意义。ELISA法检测血清学标志物（HBV－M）是确定乙肝病毒感染的传统方法，但对评估HBV感染者病毒复制、转归及预后等情况有一定的局限性。HBVDNA定量检测用于判断病毒复制的活跃程度已广泛应用于临床。乙肝病毒外膜大蛋白（HBV－LP），是病毒形成完整外膜的重要标志，与病毒复制密切相关[1]。前S1抗原（Pre－S1）是 HBV 病毒前S1基因编码的一种外膜蛋白[2]，在病毒入侵肝细胞过程中起重要作用，是HBV感染和复制的新标志。本文对864例乙型肝炎患者 HBV－LP、Pre－S1抗原、HBV－DNA载量和乙型肝炎血清标志物的检测，探讨反映不同血清学类型患者体内病毒复制及抗病毒疗效监测的最佳指标以及分析各指标之间的关系，为临床诊疗乙型肝炎提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集吉林省人民医院体检中心2009－2012年体检人员中所有乙型肝炎感染者血清标本，其中男426例，年龄23－62岁，女438例，年龄28－68岁。患者无其它类型肝炎合并感染，诊断均符合北京第五次全国传染病和寄生虫病会议修订的标准。同时以体检中心100例单项HBsAg（＋）及HBV－M全阴性体检者作为健康对照。

1.2 仪器与试剂 检测仪器包括Fluido洗板机、Reader2010酶标仪、Smartcycle荧光定量PCR仪等。血清学标志物HBV－M检测试剂购自上海科华生物工程有限公司，HBV－LP抗原、Pre－S1抗原检测试剂和HBV－DNA定量检测试剂均购自厦门英科新创科技有限公司。

1.3 检测方法 HBV－M检测采用ELISA法，目测定性检查；HBV－LP、Pre－S1抗原采用ELISA 双抗体夹心法检测，严格按照试剂盒操作说明书进行操作，选择波长450nm，通过酶标仪测定吸光度（A）值，按要求设定Cutoff值，测定结果大于Cutoff值为阳性。HBV－DNA检测采用荧光定量PCR法，病毒载量以copies／ml表示，结果以5×102copies／ml为参考临界值，大于此值为阳性。

1.4 统计学方法 所有数据输入到Excel表中，采用SPSS18.0软件进行统计学处理，计数资料组间差异采用χ2检验，计量资料组间差异采用方差分析、相关性用非参数Spearman等级相关检验分析，P＜0.05或P＜0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同HBV－M模式中HBV－LP、Pre－S1 及HBV－DNA阳性率比较 100例健康对照组HBVLP、Pre－S1及 HBV－DNA的检测结果均为阴性。不同 HBV－M模式中HBV－LP、Pre－S1 及 HBVDNA阳性例数及阳性率如表1所示。数据经χ2检验后得出：HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性模式组（大三阳）HBV－LP、Pre－S1及 HBV－DNA 阳性率显著高于其它 HBV－M 模式组（P＜0.05），提示 HBVLP、HBV DNA与HBeAg高度相关，可以反映患者体内HBV的复制水平。

表1 不同HBV－M模式中HBV－LP、Pre－S1及HBV－DNA的检出率比较

2.2 HBV－LP、Pre－S1与 HBV－DNA 阳性符合率比较 HBV－LP与 HBV－DNA的阳性率无显著差异（P＞0.05），与 HBV－DNA 阳性符合率为86.9%。Pre－S1的阳性率明显低于 HBV－LP与 HBV－DNA的阳性率（P＜0.05），与 HBV－DNA的阳性符合率为57.7%。说明HBV－LP较Pre－S1在反应病毒复制及疾病活动方面更为灵敏，HBV－LP的检测比Pre－S1更有意义。

表2 HBV－LP、Pre－S1与 HBV－DNA阳性率比较

2.3 HBV－LP、Pre－S1与 HBV－DNA 拷贝数及 HB－sAg定量值之间的相关性比较 HBV－DNA阳性的668例标本中，HBV－DNA拷贝数与 HBV－LP、Pre－S1平均A值具有显著的正相关性，而与HBsAg无明显相关性（见表3）。

表3 HBV－DNA拷贝数与HBV－LP、Pre－S1及HBsAg定量值的相关性比较

3 讨论

HBV血清标志物检测是目前诊断乙型肝炎最常用的指标，它反映了人体对乙型肝炎病毒的免疫反应状态和病程的转化过程，也是判断患者传染性及预后的传统指标。然而由于HBV血清标志物复杂多样，临床上难以根据这些结果对HBV感染复制情况进行准确判断，因此它主要反映人体对乙肝病毒的免疫反应状态，不能直接反映HBV在患者体内的复制情况。

目前临床判断患者病毒是否复制的常用指标是HBeAg和HBV－DNA，并发现部分HBeAg阴性患者HBV－DNA仍处于较高水平，说明患者体内依然有病毒大量复制。临床上通常以HBeAg和HBVDNA转阴作为抗病毒治疗的终点，然而即使如此，仍有部分患者停药后出现病情反复。HBV的S基因编码三种外膜蛋白：主蛋白（HBsAg）、中蛋白（HBsAg和 Pre－S2蛋白）、大蛋白（HBsAg、Pre－S1蛋白和Pre－S2蛋白，HBV－LP）[3]，研究证明 HBVLP在病毒复制过程中起着关键作用[4]，HBV－LP诊断试剂盒的研制成功有望为填补传统两对半试剂的空白并弥补HBV DNA检测的不足，成为抗病毒治疗终点判定的新的指标。

在本实验研究中共对864例乙型肝炎患者进行了 HBV－LP、Pre－S1抗原、HBV－DNA载量和乙型肝炎血清标志物的检测。结果显示：“大三阳”感染者中HBV－LP和HBV－DNA阳性率均较高，且显著高于其它血清模式组，同时HBV－LP和HBV－DNA的阳性率无显著差异。“大三阳”感染模式是病毒复制活跃，急性期、传染性强的模式，提示 HBV－LP、HBV DNA与HBeAg高度相关，均为评价乙型肝炎传染性及病毒复制的良好指标。在检测结果中还发现，虽然Pre－S1与 HBV－LP、HBV DNA 具有一定的相关性，但Pre－S1的阳性率明显低于HBV－LP与HBV－DNA的阳性率。这与Pre－S1的特殊结构以及试剂盒制备的局限性有关。Pre－S1检测试剂使用的单抗是用化学合成的多肽而制作的，而应用该多肽无法模拟Pre－S1形成的构象表位，因而导致Pre－S1的检出率较低[5]。最近几年的研究采用其特异结构型表位抗体检测HBV－LP取得了技术上的突破。本次实验结果也表明HBV－LP比Pre－S1试剂效果大大提高，且大蛋白的检出率与血液中病毒DNA的符合率高度符合（86.9%），可作为判断病毒复制的一个可靠指标。

进一步的检测及分析证实，不同HBV－DNA拷贝数与HBV－LP、Pre－S1的平均A值具有良好的相关性，且三者与HBsAg定量值均无相关性，再次说明HBsAg不能作为乙肝病毒复制及传染性强弱的指标，而 HBV－LP、Pre－S1可以部分作为 HBV－DNA检测的补充检测指标。

我国卫生资源分配不一，尚有很多医院不具备HBV－DNA PCR的实验水平。而免疫测定技术因其有效、直接、简便的特点，已经在临床诊断应用上占主导地位，在我国大中小型医院普遍应用，HBVLP检测有利于中小型医院也掌握血液内病毒复制指标的检测方式。进而提高临床医生的诊断和治疗水平。同时，HBV－LP的完全消退提示抗病毒治疗较为彻底，此时选择停止用药可以避免患者病情的反跳。HBV－DNA与HBV－LP的联合检测对于临床判断病情、选择最佳治疗方案、检测病情变化和观察临床疗效具有重要的意义。

[1]Wang NY，Zhang D，Zhao W，et al.Hepatitis B virus large surface protein in serum as a candidate biomarker for evaluating hepatitis B virus infection[J].Clin Biochem，2011，44（14－15）：1199.

[2]Zhang ZH，Peng J，Xia JB，et al.S gene mutations in HBsAg／HB－sAb double positive chronic hepatitis B patients[J].Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2009，17（4）：266.

[3]Zhu X，Gong Q，Yu D，et al.Early serum hepatitis B virus large surface protein level：A stronger predictor of virological response to peginterferon alfa－2athan that to entecavir in HBeAg－positive patients with chronic hepatitis B[J].J Clin Virol，2013，57（4）：318.

[4]Wang NY，Zhang D，Ge YW，et al.Clinical significance of measuring hepatitis B virus large surface protein in serum[J].Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi，2010，24（5）：349.

[5]Le DY，Blanchet M，Sureau C.The pre－S1and antigenic loop infectivity determinants of the hepatitis B virus envelope proteins are functionally independent[J].J Virol，2009，83（23）：12443.