急性白血病细胞系中SFRP基因启动子甲基化及去甲基化诱导表达的研究

徐成波， 冯 敏， 廖 斌， 皇甫真萍， 齐 彦， 陈毅宁， 陈佳薇， 沈建箴

(1福建中医药大学附属人民医院血液科，福建福州350004;2福建省立医院北院，福建省老年医院内分泌科，福建福州350001;3福建医科大学附属协和医院血液科，福建福州350001)

Wnt信号通路的过度激活参与了人类多种肿瘤的形成，被认为是肿瘤发生过程中的关键信号通路。分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related protein，SFRP)作为Wnt信号通路的胞外拮抗物，能通过多种机制抑制经典和非经典的Wnt通路［1］，阻断异常激活的Wnt信号，促进肿瘤细胞凋亡，达到抑制肿瘤的形成与发展。为了探讨SFRP基因家族启动子CpG岛异常甲基化状态在急性白血病(acute leukemia，AL)发生发展中的作用，本研究拟采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)的方法检测白血病细胞系和不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞苷酸(5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR)作用下 Jurkat细胞中 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因启动子区的甲基化，并检测 SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5、DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)1、DNMT3A 和 DNMT3B mRNA表达的变化，以期从表观遗传学水平揭示AL的发病机制。

材料和方法

1 材料

实验用急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)细胞为Molt-4和 Jurkat细胞，急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)细胞为HL-60和NB4细胞，均由福建省血液病研究所传代保存。

小牛血清(杭州四季青公司);RPMI-1640培养基(Gibco);5-Aza-CdR、蛋白酶K、RNA酶、亚硫酸氢钠和氢醌(Sigma);淋巴细胞分离液和酚-氯仿DNA抽提液(上海生物工程公司);焦碳酸二乙酯(DEPC)和Trizol试剂(上海生物工程公司);Wizard DNA树酯纯化试剂盒(Promega);Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG试剂盒(Invitrogen);2×Taq PCR Master Mix试剂(北京博迈德生物公司);DNA marker(厦门鹭隆生物有限公司)。引物由Invitrogen合成。

37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱(Heal Force);DU-640紫外分光光度仪(Beckman Coulter);Gel Doc 1000凝胶图像分析仪(Bio-Rad);7700型PCR扩增仪和7500型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)。

2 方法

2.1 细胞培养及干预实验 所用AL细胞均常规复苏后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(pH 7.2)，于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，隔天传代1次，实验用细胞为对数生长期细胞。SFRP基因去甲基化实验中，取对数生长期的Jurkat细胞，调整细胞浓度为1×109/L，并接种于培养瓶中，未处理组细胞即不加药培养72 h作为空白对照，其余分别加入5-Aza-CdR 1μmol/L、2μmol/L和4μmol/L处理，共培养72 h，用药结束后，收集各组细胞，进行DNA和RNA的提取，用于进一步的研究。

2.2 正常人骨髓或外周血单个核细胞的提取 骨髓穿刺检查或抽取外周血时，留取骨髓标本或外周血2 mL，肝素抗凝。在离心管中加入2倍体积的淋巴细胞分离液，颠倒混匀。将骨髓标本或血标本离心20 min。离心后，上层为血清，中间层为单个有核细胞，下层为红细胞和血小板。小心吸取中间层的单个核细胞，洗涤离心后备用。

2.3 细胞基因组DNA的提取 收集各实验组细胞以及正常人骨髓或外周血单个核细胞，常规酚-氯仿法提取细胞基因组DNA，并通过紫外分光光度仪鉴定其含量及纯度。用去离子水溶解后于-20℃保存。

2.4 基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰与纯化 参考Herman等［2］的方法并加以改进，取1～2μg DNA溶解于50μL去离子水中，加3 mol/L NaOH 5.5μL，37℃水浴30 min。向碱变性的DNA中加入新配置的10 mmol/L氢醌30μL和3 mol/L亚硫酸氢钠520 μL，以矿物油3滴覆盖液面，50℃水浴16 h。再用Wizard DNA Clean-Up System纯化，纯化后的DNA加3 mol/L NaOH 5.5μL，室温放置15 min，用预冷的70%乙醇沉淀DNA，并以30μL去离子水溶解，-20℃储存备用。

2.5 MSP检测 取经亚硫酸氢钠修饰后的DNA 3 μL为模板，采用25μL体系进行扩增，体系包含12.5μL的2×Taq PCR Master Mix，甲基化或非甲基化的上、下游引物各0.5μL，补足水至25μL。反应条件为95℃预变性4 min，95℃ 45 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环，72℃ 10 min。同时，以修饰后的正常人骨髓或外周血单个核细胞DNA为非甲基化阴性对照，将已经证实均存在 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因高甲基化的人结直肠癌细胞系RKO细胞DNA为甲基化阳性对照［3］，H2O作空白对照。将PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶图像分析仪上自动分析成像。应用甲基化引物扩增出基因甲基化产物的细胞，定为该基因完全甲基化;应用非甲基化引物扩增出基因非甲基化产物的细胞，定为该基因完全非甲基化;同时可扩增出甲基化和非甲基化产物的细胞，定为该基因部分甲基化。

2.6 实时荧光定量RT-PCR检测SFRP mRNA的表达水平 各组细胞至培养终点后以Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，并鉴定RNA的完整性。以2μg RNA为模板逆转录合成cDNA，实时定量RT-PCR采用7500型荧光定量PCR仪和Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG试剂盒进行PCR扩增，以GAPDH为内参照。采用与GAPDH比较Ct值的方法来定量mRNA表达水平，实验重复3次。

2.7 半定量RT-PCR检测DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA的表达水平 采用7700型PCR扩增仪和2×Taq PCR Master Mix试剂盒进行PCR扩增，以GAPDH为内参照，将PCR产物于2.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶图像分析仪上自动分析成像，以目的条带与GAPDH条带的吸光度比值进行半定量分析，实验重复3次。

3 统计学处理

计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，SPSS 17.0统计软件分析数据，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 AL细胞系中SFRP基因的甲基化状态

在 Molt-4、Jurkat、HL-60 和 NB4 细胞中，应用甲基化引物可扩增出的 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化产物特异性条带，同时应用非甲基化引物在HL60细胞中可扩增出SFRP4基因的非甲基化产物，表明 SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因在Molt-4、Jurkat和NB4细胞中均呈完全甲基化状态，而 HL-60细胞中 SFRP1、SFRP2和SFRP5呈完全甲基化状态，而SFRP4基因呈部分甲基化状态，见图1。正常人骨髓或外周血单个核细胞应用非甲基化引物可扩增出SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的非甲基化特异性条带，而甲基化引物不能扩增出特异性产物，表明正常人细胞中SFRP基因均呈非甲基化状态。

Figure 1.MSP analysis of SFRP1，SFRP2，SFRP4 and SFRP5 genes in Molt-4，Jurkat，HL-60 and NB4 cell lines.M:methylated;U:unmethylated;NC:negative control;PC:positive control;H2 O:blank control.图1 4种AL细胞中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化分析

2 SFRP2基因甲基化MSP产物的序列分析

为了证实MSP分析基因甲基化的可靠性，随机挑选了SFRP2基因甲基化引物扩增的PCR产物，经T-A克隆后测序。测序结果证明该MSP产物是野生型(wild-type)SFRP2基因启动子区的部分序列，其分析结果完全可靠。甲基化的SFRP2基因，其CpG岛二核苷酸中的胞嘧啶(C)碱基未被亚硫酸氢盐硫化改变，仍为C碱基;而在非CpG岛中的C碱基经亚硫酸氢盐修饰后都转变成胸腺嘧啶(T)碱基，见图2。

Figure 2.Sequence analysis of the MSPproduct of methylated SFRP2 gene after bisulfite treatment.Wild-type cytosine(C)residues that were methylated in CpGislands(framed)remained unchanged，and Cresidues that were unmethylated were changed to thymidine(T)by bisulfite-induced deamination(underlined).图2 SFRP2基因甲基化MSP产物的序列分析

3 Jurkat细胞经5-Aza-Cd R处理后SFRP基因甲基化水平的改变

用不同浓度5-Aza-CdR处理Jurkat细胞72 h后，MSP分析显示，随着5-Aza-CdR浓度的升高，SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化水平(吸光度值)逐渐降低，见图3，提示SFRP基因的高甲基化状态被逆转。

Figure 3.MSPanalysis of SFRP genes in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR for 72 h.图3 5-Aza-Cd R处理Jurkat细胞后SFRP基因甲基化水平的变化

4 Jurkat细胞经5-Aza-Cd R处理后SFRP mRNA表达水平的改变

4 μmol/L 5-Aza-CdR 组中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5 mRNA表达水平均明显升高，分别是未处理组中表达水平的4.6、3.5、2.3和4.2倍(均P＜0.01)，见图4，提示SFRP基因的高甲基化状态被逆转后，甲基化沉默的SFRP基因被激活转录。

Figure 4.The mRNA expression levels of SFRP in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR at the concentration of 4 μmol/L.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control.图4 5-Aza-CdR处理Jurkat细胞72 h后SFRP mRNA表达水平的变化

5 Jurkat细胞经5-Aza-Cd R处理后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达水平的变化

半定量RT-PCR检测发现，随着5-Aza-CdR浓度升高以及SFRP基因甲基化水平的降低，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA的表达水平均有下调，且呈剂量依赖性，各药物作用组与未处理组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图5。

Figure 5.Semiquatitative RT-PCR analysis of DNMT1，DNMT3A and DNMT3B mRNA expression in Jurkat cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR for 72 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0μmol/L.图5 5-Aza-CdR处理Jurkat细胞后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达水平的变化

讨 论

DNA甲基化是真核生物基因组最常见的一种表观遗传学修饰方式，它对X染色体灭活［4］、基因组印迹［5］、DNA 修复［6］和基因表达调控［7］等起着非常重要的作用。基因组特定序列的低甲基化或高甲基化都会使基因的表达发生变化。大约90%的DNA甲基化发生在启动子区的CpG岛，正常生理条件下绝大部分启动子CpG岛均处于非甲基化状态，一旦基因的CpG岛发生高甲基化将直接导致基因的转录失活。

Wnt信号通路调控着细胞的增殖、分化、极化、凋亡与抗凋亡等许多生命过程［8］。研究表明，Wnt异常信号通路激活癌症的重要机制是一种或多种可溶性Wnt抑制基因的甲基化沉默所致，SFRP作为Wnt信号通路的负调控因子，其基因表达下调可引起Wnt信号通路持续异常激活，从而最终引起包括胃肠道肿瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌及间皮瘤等肿瘤的发生，被认为是肿瘤发生过程中的关键信号通路［9］。

SFRP作为Wnt信号途径的“门户”，在正常情况下能有效地抑制Wnt途径的异常激活。但是，在SFRP基因发生甲基化沉默后则失去这种作用［10］。Chim等［11］利用骨髓瘤细胞株及原发性骨髓瘤标本研究Wnt信号通路的激活情况，发现在4组细胞株中，LP1及WL2细胞株存在Wnt信号的异常激活，且与多种Wnt抑制基因超甲基化沉默有关，去甲基化后抑制基因可重新恢复表达，Wnt通路活化水平也开始下调。同时，在初发多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者中，有42%的患者存在至少一种抑制基因的甲基化，其中61.9%有2种以上抑制基因的甲基化。Jost等［12］对76例初治MM患者的SFRP基因进行甲基化检测，发现有35.5%的 SFRP1、52.6%的SFRP2、1.3%的SFRP4和6.9%的SFRP5存在高甲基化，而且SFRP5的高甲基化可能与疾病的进展有关。Liu等［13］在对20例慢性B淋巴细胞白血病患者的研究中发现，SFRP基因普遍存在DNA甲基化沉默，SFRP1、SFRP2和SFRP5基因基因的甲基化比率分别是100%、55%、30%和15%。

本研究应用 MSP技术检测发现，SFRP1、SFRP2、SFRP4 和 SFRP5 基因在 Molt-4、Jurkat和NB4细胞中均呈完全甲基化状态，而HL-60细胞中SFRP1、SFRP2和SFRP5基因呈完全甲基化状态，SFRP4基因呈部分甲基化状态，因此推测，SFRP基因在AL中发生高频率甲基化。

白血病的DNA去甲基化治疗已成为AL治疗研究的新热点［14］。去甲基化药物5-Aza-CdR是美国FDA批准的第一批用于治疗MDS的表观遗传药物。5-Aza-CdR过去主要作为抗肿瘤细胞毒药物使用，阻断细胞向S期转化。本实验发现5-Aza-CdR作用Jurkat细胞72 h后，随着药物终浓度的增加，SFRP mRNA的表达水平随着甲基化程度的降低而增高，这表明SFRP基因去甲基化后重新恢复表达。与此同时，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达水平也呈剂量依赖性的表达下调。由于5-Aza-CdR是核苷类似物，磷酸化后能与DNMT形成共价复合物，抑制其与DNA结合发挥甲基化活性，从而诱导DNA去甲基化［15］。因此，推测5-Aza-CdR可能通过抑制DNMT表达，阻断DNMT转移S-腺苷蛋氨酸的甲基于CpG岛的5-胞嘧啶上而逆转DNA启动子区CpG岛的甲基化，重新激活因高甲基化而处于沉默的SFRP基因，而达到去甲基化激活转录的作用。但是由于5-Aza-CdR对基因的去甲基化作用缺乏细胞特异性，它在治疗异常甲基化的同时，可能会引起处于抑制状态的某些基因恢复活性，导致正常基因调控机制的紊乱，所以5-Aza-CdR广泛应用于临床还需要进一步的探索。