皖南蝮蛇毒PCA在DIC诊断中的应用

段 婷，张根葆，2，周 兵

(皖南医学院 1.病理生理学教研室;2.蛇毒研究所，安徽 芜湖 241002)

弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)是一种在原发病基础上由致病因素诱发的以凝血功能紊乱为特点的继发性综合征，临床最常见病因为感染，包括细菌、病毒等感染和败血症，且易诱发多器官功能衰竭，病情凶险，预后较差［1－3］。近年来，蛋白C系统在DIC等危重疾病中的作用受到越来越多临床医师的关注［4］。最近研究发现，蛋白C途径受损引起的活化蛋白C(active protein C，APC)生成减少，将导致凝血功能异常，是多器官功能障碍综合征的一个重要发病机制［5］，在DIC的发生发展中，血浆PC活性水平下降对疾病的预后具有重要意义，PC活性高低与病死率有密切关系，对PC活性的持续监测能反映病人的预后和治疗效果［6－7］。因此监测血浆PC活性水平的变化可用于判断DIC的发生、发展及预后。但目前关于PC活性在DIC中的连续变化的研究报道较少，可能与目前PC活性的检测方法尚未完全统一有关。目前发色底物法为国际通用且较为认可的蛋白C活性检测方法［8］。自 1986 年 Stockear［9－10］等首次发现并分离出蛇毒PC激活物Protac以来，真正形成商品化的PC活性检测产品甚少［11］，且进口Protac价格昂贵，使临床应用受到限制。近年来，皖南医学院蛇毒研究所从皖南蝮蛇毒中提取出PC激活组分(PCA)［12］，根据PC活性检测原理，研制出发色底物法PC活性检测试剂，前期［13］实验表明能有效激活血浆蛋白C，并与进口Protac生物学活性相似，且应用简便、结果稳定，特异性强等。

因此，本研究通过建立内毒素诱导的DIC家兔模型，采用皖南医学院蛇毒研究所研制的蛇毒PC激活剂(PCA)，以发色底物法检测DIC时血浆PC的活性变化，观察血浆PC活性在DIC发生过程中的变化规律，以探讨PC活性检测试剂在DIC诊断的应用，为进一步将PC活性检测试剂应用于基础研究及临床诊断提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 健康雄性日本大耳白兔20只，体质量1.8～2.2 kg，清洁级，购自江苏省南京市青龙山动物中心，按实验动物国家标准喂养，许可证号:2020760。

1.1.2 实验试剂及仪器 内毒素(Escherichia coli 055:B5 LOT2009106):美国 Sigma公司(10 mg/支)。PC激活剂为皖南医学院蛇毒研究所制备的冻干粉，－20℃冰箱储藏备用。凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间 (APTT)和纤维蛋白原(FIB)检测试剂盒均购于上海太阳生物技术有限公司。Model-680酶标仪:美国伯乐公司，MC-2000双通道凝血仪:德国美创公司，低温高速离心机:北京医用离心厂等。

1.2 方法

1.2.1 内毒素诱导兔DIC模型的建立 参照Hermida等［14］用 LPS诱导兔 DIC的方法建立动物模型。3%戊巴比妥钠按1 ml/kg从家兔耳缘静脉注射麻醉，分离右侧股动脉、插管，以备取血，实验结束后结扎右侧股动脉，缝合皮肤。LPS溶于60 ml生理盐水中，随后以100 μg/(kg·h)(10 ml/h)的速度从兔耳缘静脉滴注给药，连续6 h，给药后根据兔麻醉深度可适当给予戊巴比妥钠腹腔注射，以维持动物的持续麻醉状态，建立稳定的兔DIC模型。

1.2.2 动物分组 新进雄兔在动物室饲养1周，给予清洁的水和食物，使之适应环境。符合实验标准的雄兔20只，随机分为生理盐水(NS)对照组和内毒素(LPS)组，每组10只。

1.2.3 给药方法

1.2.3.1 生理盐水(NS)对照组 从兔双侧耳缘静脉以10 ml/h的速度滴注生理盐水，连续给药6 h。

1.2.3.2 DIC 模型组 在兔一侧耳缘静脉滴注100 μg/(kg·h)(10 ml/h)LPS 的同时，从对侧耳缘静脉以10 ml/h的速度滴注生理盐水，连续给药6 h。

1.3 样本采集和处理 各组均在静脉滴注1 h、2 h、3 h、4 h、6 h 时分别从股动脉取血 1 ml，以3.8%枸橼酸钠(1∶9)抗凝，3 000 r/min离心 10 min，分离血浆，抽取100 μl血浆，－20℃冰冻保存待测;余血浆检测凝血功能各指标，2 h内检测完毕。从给药开始，记录实验动物的24 h生存率，24 h内死亡的动物即时解剖，取肺，肝，肾做病理切片。24 h观察期结束后，将各组存活动物处死、解剖，取主要脏器做病理切片。

1.4 蛋白C(PC)测定原理 血浆PC活性测定为发色底物法，原理［15］:Protac(一种蛇毒提取物)能特异性地激活PC，使PC转化为活化蛋白C(APC)，APC作用于发色底物Chromozym-P，释放出产色基团对硝基苯胺(PNA)，产色深浅与 APC呈线性关系。

1.5 数据处理 使用SPSS 17.0统计软件。两组间比较采用t检验，各组不同时点比较采用F检验。

2 结果

2.1 日本雄性大耳白兔注射内毒素后情况及24 h病死率 正常对照组兔:精神状态良好，毛色光泽，反应灵敏，进食正常，睡眠尚可，24 h观察期内无死亡例数。LPS实验组兔:注射内毒素后，精神萎靡，反应迟钝，拱背蜷卧，毛色光泽差，呼吸急促，寒战，腹泻，口周发绀。LPS实验组上述症状持续10 h，10 h时全组死亡5只，24 h时共死亡8只，病死率80%。

2.2 LPS实验组凝血指标与NS对照组比较 从表1可见，LPS实验组滴注LPS 2 h时，APTT开始延长，为(20.87 ±2.02)s，与 NS组比较有差异(P ＜0.05);4 h、6 h 时 APTT 值明显延长，分别为(24.60±2.36)s、(30.29 ±2.17)s，与 NS 组比较有显著差异(P ＜0.05)。同时PT 值也延长，在4 h、6 h时，分别为(11.23 ±2.18)s、(12.8 ±2.81)s，与 NS 组比较差异显著(P＜0.05)。而FIB值在滴注LPS后持续下降，在 4 h、6 h 时，分别为(2.37 ±0.31)g/L、(1.72±0.08)g/L，与 NS 组比较差异显著(P ＜0.05)。

表1 DIC模型组凝血指标与NS对照组比较(±s，n=10)Tab 1Comparison of the coagulation indicators between DIC model group and NS group(±s，n=10)

表1 DIC模型组凝血指标与NS对照组比较(±s，n=10)Tab 1Comparison of the coagulation indicators between DIC model group and NS group(±s，n=10)

PT:凝血酶原时间;APTT:活化部分凝血活酶时间;FIB:纤维蛋白原

指标 组别 时间(h)1 2 3 4 F P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 87 ＜0.05 LPS 组 8.74 ±0.97 9.61 ±1.87 11.23 ±2.18 12.80 ±2.81 7.551 ＜0.05 t 1.625 1.710 4.009 4.492 P＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 APTT(s)NS 组 15.32 ±0.23 15.53 ±0.21 16.69 ±0.44 16.96 ±0.89 24.826 ＜0.05 LPS 组 16.21 ±0.88 20.87 ±2.02 24.60 ±2.36 30.29 ±2.17 93.696 ＜0.05 t 3.094 8.315 10.419 17.973 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 FIB(g/L)NS 组 4.12 ±0.19 4.00 ±0.13 3.90 ±0.10 3.88 ±0.08 6.974 ＜0.05 LPS 组 3.97 ±0.6 3.50 ±0.09 2.37 ±0.31 1.72 ±0.08 90.035 ＜0.05 t 0.754 10.001 14.854 60.374 P PT(s)NS 组 8.23 ±0.21 8.58 ±0.36 8.44 ±0.30 8.76 ±0.44 4.3

2.3 LPS实验组血浆蛋白C活性指标变化与NS对照组比较 从表2可见:LPS实验组静脉滴注LPS 1 h后，日本雄性大耳白兔的PC活性为(72.57±10.6)%，较 NS组下降明显(P ＜0.05)。提示蛋白C系统受影响，血浆PC活性已开始下降。LPS输注2 h、3 h，PC 活性持续下降，分别为(67.48±7.27)%、(61.17 ±9.25)%，较 NS 组下降更明显(P＜0.05)，提示血浆PC活性下降的程度与DIC的发展相关。在LPS滴注6 h时，PC活性下降到最低点，为(52.97±5.87)%，与 NS组比较差异显著(P＜0.05)。提示蛋白C系统受影响程度与机体DIC的发展程度有密切关系。

表2 LPS实验组蛋白C(PC)活性指标变化与NS对照组比较(±s，n=10)Tab 2 Comparison of PC activity between DIC model group and NS group(±s，n=10)

表2 LPS实验组蛋白C(PC)活性指标变化与NS对照组比较(±s，n=10)Tab 2 Comparison of PC activity between DIC model group and NS group(±s，n=10)

时间(h)NS组PC活性(%)LPS组PC活性(%)t P 1 h 102.76 ±10.47 72.57 ±10.6 6.408 ＜0.05 2 h 99.08 ±9.97 67.48 ±7.27 8.099 ＜0.05 3 h 97.48 ±11.43 61.17 ±9.25 7.809 ＜0.05 4 h 99.80 ±6.91 58.42 ±6.72 13.576 ＜0.05 6 h 98.20 ±6.26 52.97 ±5.87 16.667 ＜0.05

2.4 肝、肾、肺病理改变 肝脏:LPS实验组镜下可见肝细胞广泛水肿，无坏死，部分肝细胞出现脂肪变，肝窦扩张，中央静脉扩张，汇管区小叶间静脉充血较明显(见图1B)。肾脏:LPS实验组镜下可见肾间质血管扩张充血较明显，小管上皮细胞广泛水肿，无坏死，肾小球形态无特殊，微血管内易见纤维蛋白微血栓形成(见图1D)。肺脏:LPS实验组镜下可见肺间质血管扩张充血明显，肺泡间隔明显增宽，肺间质内可见大量炎性细胞浸润，部分肺泡腔内可见炎细胞渗出，部分可见灶性出血及微血栓形成(见图1F)。

3 讨论

内皮细胞的炎症损伤是感染所致DIC发生发展过程的突出特点，并对PC抗凝系统产生影响，持续监测PC活性能反映病人的预后和治疗效果［9－10］。但目前关于PC活性在DIC中连续变化的研究报道较少，且国内也尚无类似Protac的PC活性检测试剂商品面世。

本实验用连续静脉滴注LPS诱导兔DIC发生的方法建立动物模型，结果显示，给予LPS后，FIB值呈显著降低，PT值、APTT值呈进行性升高，病理切片肝、肾、肺组织出现损伤改变及微血管中纤维蛋白微血栓形成等，确认了用LPS诱导兔DIC模型造模成功。实验结果显示，LPS组给予LPS静脉滴注1 h时，PC系统即有明显受抑的表现，PC活性出现下降，明显低于正常对照组，而此时 APTT、PT与FIB尚未出现明显异常。LPS静脉滴注2 h时，APTT、PT才开始延长，FIB才开始下降，PC活性则继续下降，提示PC活性指标异常比凝血指标出现得更早，更敏感。随着LPS持续滴注和DIC进展，APTT、PT进行性延长，FIB与 PC活性持续下降。LPS静脉滴注6 h时PC活性下降到最低，提示PC活性受损程度与DIC的发生、发展程度密切相关。因此，检测血浆PC活性及变化趋势对DIC的早期预测、诊断及预后具有重要的临床应用意义和价值。

图1 DIC实验组病理组织图片(HE×40)A:NS对照组肝组织正常;B:DIC实验组肝组织，部分肝细胞出现脂肪变;C:NS对照组肾组织正常;D:DIC实验组肾组织，箭头显示肾微血管中的纤维蛋白微血栓;E:NS对照组肺组织正常;F:DIC实验组肺组织，箭头显示肺微血管中的纤维蛋白微血栓Fig 1 Pathological sections from DIC models and NS group(HE×40)A:Indicating the normal liver tissue from the control group;B:Liver tissue from the DIC group shows partial adipose degeneration;C:Suggesting normal kidney tissue in the control group;D:Kidney tissue in the DIC group indicates microvascular fibrin micro-thrombosis as shown by the arrow;E:Normal lung tissue for the control group;F:Lung tissue in the DIC group presents with microvascular fibrin micro-thrombosis as shown by the arrow

目前，PC的检测方法主要有活化部分凝血活酶时间(APTT)法、抗原测定法及发色底物法(CSA)。CSA采用比较特异性的发色底物，操作简便易行，结果准确且重复性好［16－17］，所以通常采用 ELISA 法或发色底物法［18］。世界卫生组织(World Health Orgnization，WHO)亦推荐CSA为PC的检测方法。目前临床上对DIC的早期预测、诊断及预后价值的指标并不多，PC活性的连续监测有望成为其预测、诊断及预后的参考指标。本研究提示PC活性检测试剂具有良好的应用及科研前景。

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