体外重组CaV1.2不同蛋白片段纯化及其与CaM相互作用的研究

何桂林，邵冬雪，印丹丹，胡慧媛，郭凤，王红梅，郝丽英

（1.中国医科大学药学院药物毒理教研室，沈阳 110001；2.江西省人民医院药剂科，南昌 320006）

细胞外钙内流在肌肉收缩、腺体分泌、细胞运动以及递质释放等生理过程中起着非常重要的作用［1，2］。心肌细胞中，细胞外钙内流主要通过 L-型钙通道。L-型钙通道C末端的多个序列、N末端以及Ⅰ-Ⅱ片段可与多种调节因子相互作用而调节通道活性［2～4］，其中C末端的CT1序列是与CaM、CaMKⅡ、Calpastatin等多种调节因子相互作用的共同序列［5～7］。CaM是一种广泛存在于生物体的钙结合蛋白，是细胞内钙的重要受体，参与细胞中多种酶和生理过程的调节［8］，与Ca2+形成Ca2+/CaM复合物而发挥生理学功能［9］。钙通道蛋白分离纯化方法较多［4，10，11］，但 CaV1.2 钙通道蛋白中的 CT1 片段因难溶于水而较难纯化［12］。本研究改进完善了CaV1.2钙通道C末端CT1、CT2和CT3的分离纯化，并利用GST pull-down assay实验技术探讨了CT1、CT2和CT3与CaM及突变体的结合。

1 材料与方法

1.1 材料

pGEX-6p-3/CaM、pGEX-6p-3/CaM12 （E31A+E67A）、pGEX-6p-3/CaM34 （S101F+E140A）、pGEX-6p-3/CaM1234（E31A+E67A+S101F+E140A）质粒均由日本鹿儿岛大学Kameyama教授惠赠；pGEX-6p-3/CT1、pGEX-6p-3/CT2和pGEX-6p-3/CT3由生工生物工程（上海）有限公司制作；异丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、溶菌酶、AMP均购自Sigma公司；PreScission Protease 与 Glutathione-Sepharose 4B beads（GS-4B beads）购自GE Healthcare公司。其他试剂均购自BIOSHARP公司。

1.2 方法

1.2.1 重组菌株培养及 GST-CT1、GST-CT2、GSTCT3表达：将CaV1.2 C-末端的3个融合蛋白（CT1，a.a.1509-1789；CT2，a.a.1778-2003；CT3，a.a.1942-2169，图1）相对应的重组质粒转化入BL21（DE3）中，挑取单克隆菌落于5 mL LB/Amp+培养液中，37°C振摇培养至对数生长期（A595=0.6～1.0），保留菌种［13］。取适量菌种加入装有400 mL LB（含AMP 50 μg/mL）培养液的锥形瓶中，37 °C、120 r/min 震摇培养12～16 h。当A595值在0.6～1.0之间时，加入IPTG 至 1 mmol/L，37 °C、120 r/min 震摇培养 4 h，诱导融合蛋白表达。

图1 CaV1.2、CaM及其突变体结构示意图Fig.1 Schematic diagram of fragment peptides of CaV1.2，CaMand its mutants

1.2.2 CT1、CT2、CT3的提取与纯化：所有操作均在冰上进行，所有离心均为4°C离心。菌液离心（6 000 r/min，10 min），弃上清，用含 1.5%N-lauroylsarcosine sodium salt（Sigma公司）PBS重悬沉淀菌体，冰浴30 min；超声打破细菌，超声3 s停 3 s，200 W，20 min；加入 Triton X-100 至1%，冰浴 30 min；16 000 r/min离心 10 min，将上清转移至2个15 mL离心管中，每个离心管中加有500 μL GS-4B beads（预先各管每次用5 mL PBS洗2次），置旋转混合器充分混合4 h（10 r/min）。600 r/min离心3 min，弃上清。各管加入5 mL PBS，600 r/min离心3 min，弃上清，洗3～5次。每个管中加入1 000 μL Tris buffer（50 mmol/L Tris pH 8.0，150 mmol/L NaCl），4°C保存。参照Bradford蛋白浓度测定试剂盒方法测定纯化后的GST-CT1、GST-CT2和GSTCT3的浓度，使其浓度约为0.04 g/L。

1.2.3 CT1、CT2、CT3蛋白鉴定：取连接于beads上的 CT1（CT2 或 CT3）50 μL，600 r/min，3 min，弃上清。加入10 μL 5×SDS洗脱连于beads上的目的蛋白，100°C 煮 10 min，离心，上清行 15%SDS-PAGE电泳，检测 CT1、CT2、CT3 蛋白。

1.2.4 CaM、CaM12、CaM34和 CaM1234分离纯化：CaM12是CaM的N-lobe 2个钙结合位点发生突变，失去与钙离子结合能力；CaM34是CaM的C-lobe 2个钙结合位点发生突变；CaM1234是CaM两端的钙结合位点均发生突变（图1）。CaM及突变体蛋白的分离纯化参照文献［13］。

1.2.5 GST pull-down assay 分别观察 CT1、CT2、CT3与CaM及突变体的相互作用：取连接于beads上的CT1（CT2或 CT3）50 μL于 1.5 mL EP管中，加入CaM （终浓度分别为0.1、0.35、0.7、1.4、2.1、3.5 μmol/L）、CaCl220 μL （［Ca2+］2 mmol/L）、Tris buffer至1 mL。将1.5 mL EP放于旋转混合器上，10 r/min，4 °C，4 h。600 r/min，3 min，弃上清。加入 1 mL Tris buffer轻轻混匀，600 r/min，3 min，弃上清（轻洗2遍）。加入 15 μL 5×SDS洗脱。600 r/min，3 min，上清用15%SDS-PAGE电泳确认。SDS-PAGE胶上的蛋白带通过考马斯亮蓝染色显示，并采用Photoshop软件进行定量分析。

1.2.6 数据分析：总量［CaMs］—结合［CaMs］的关系曲线用SigmaPlot 10.0软件中的Hill公式进行拟合，其拟合公式如下

其中Bmax为最大结合量，X为游离配体浓度，Kd为表观分离常数。本实验中的游离CaM浓度接近于CaM总浓度，所以X即为CaM总浓度。

2 结果

2.1 GST-CT1、GST-CT2、GST-CT3 与 CaM 的相互结合作用结果

CaV1.2 C-末端的3个融合蛋白片段：GST-CT1、GST-CT2和GST-CT3，其中GST-CT1包含了 EF-hand，preIQ和IQ序列（图1）。结果表明：成功纯化得到 GST-CT1、GST-CT2和 GST-CT3；在 2 mmol/L［Ca2+］，CaM几乎不与空白GS-4B或GST结合；纯化的3个CaV1.2 C-末端的3个融合蛋白片段，只有GST-CT1可与CaM稳定结合（图2）；作为对照，CaM几乎不与空白GS-4B或GST结合，表明CaM可特异性地与GST-CT1结合（图2）。

图2 纯化后GST-CT1、GST-CT2、GST-CT3与CaM的相互结合作用Fig.2 SDS-PAGE of purified GST-CT1，GST-CT2，GST-CT3which interacted with CaM

2.2 CaM与GST-CT1结合的浓度依赖性

如图3所示：在2 mmol/L［Ca2+］条件下，随着反应体系中的CaM浓度增加，结合到GST-CT1上的CaM量也逐渐增加，呈浓度依赖性，在此剂量范围内，其浓度—结合量的拟合曲线为“S”型。

图3 CaM与GST-CT1结合的浓度依赖性Fig.3 Concentration-dependent binding of CaM to CT1

2.3 GST-CT1与CaM突变体结合的浓度依赖性

CaM与Ca2+形成Ca2+/CaM复合物之后才能与CaV1.2上的CaM结合位点结合发挥生理作用，突变后的CaM很难与之结合［9，14］。CaM的N-lobe和C-lobe在调节通道活性上具有不同的作用［3，15］。因此，本实验还研究了在2 mmol/L［Ca2+］条件下CaM 3种突变体与GST-CT1的结合。结果表明：CaM12、CaM34、CaM1234均可与GST-CT1结合，且随着反应体系中CaM突变体浓度的增加，结合到GST-CT1上的量也逐渐增加（图4），浓度—结合量的拟合曲线为“S”型。在 2 mmol/L［Ca2+］条件下，CaM 3 种突变体可以与GST-CT1结合，并具有浓度依赖性，但是在同一浓度，它们结合到CT1的量明显低于野生型CaM结合到CT1的量。

图4 CaM突变体与GST-CT1结合的浓度依赖性Fig.4 Concentration-dependent binding of CaM mutants to CT1

3 讨论

细胞内钙在生物信息传递和内环境稳定中起重要作用。细胞外钙内流主要通过钙通道，钙通道主要包括电压依赖性钙通道（voltage-dependent calcium channel，VDCC）和受体操控钙通道（receptor-operated channel，ROC）。VDCC 根据通道电导、对电压敏感性及对不同阻断剂反应的不同，又进一步分为L、N、T、P、Q和R型，其中L型钙通道是目前最具药理学意义的一类钙通道，其激活电位为-10～+10 mV，通道被激活后持续时间长，失活慢。L-型钙通道广泛存在于各种细胞中，尤其是心肌和血管平滑肌细胞，功能上与兴奋—收缩耦联、兴奋—分泌耦联有密切关系。在蛋白家族分类上，根据钙通道α1亚基氨基酸序列的不同，钙通道分为CaV1-3的3个亚家族：其中CaV1.x中的CaV1.1，CaV1.2和CaV1.3均介导L-型钙通道电流，CaV2.x中的CaV2.1、CaV2.2和CaV2.3分别介导 P/Q型、N型和 R型，而CaV3.x介导T型钙电流。

CaM是一种广泛存在于生物体的钙结合蛋白，它是细胞内钙的重要受体，参与动植物细胞中多种酶和生理过程的调节。CaM是调节L-型钙通道活性过程中的钙感受器［3，9］，且钙通道C末端A、C或CB、IQ区域、N末端以及Ⅰ-Ⅱ环等区域均可以与CaM结合，从而调节CDF和CDI，其中α1c亚基C末端的IQ基序是最受公认的CaM结合位点。

GST pull-down assay是研究蛋白之间相互作用的重要实验方法。其基本原理是将靶蛋白—GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，诱饵蛋白可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白（目的蛋白）”，洗脱结合物后通过SDSPAGE电泳分析，从而证实2种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

本研究采用GST pull-down assay实验方法，将CaV1.2的C末端分成CT1（包含EF-hand、CB、IQ基序）、CT2、CT3 3个片段作为“诱饵蛋白”，其中 CT2、CT3作为对照，分别研究其与“捕获蛋白”CaM之间的相互作用。本研究结果证明在大肠杆菌中表达的融合蛋白经GS-4B纯化后的CT1蛋白纯度及浓度均较好；纯化后CT1可稳定与Ca2+/CaM结合，表明此方法纯化后的蛋白具有生物学活性；CaM可特异性地与CT1结合，且结合呈浓度依赖性；CaM的3种突变体也可与GST-CT1结合，并具有浓度依赖性。综上所述，本研究成功纯化了CaV1.2蛋白片段并顺利完成GST pull-down assay实验，为深入研究蛋白相互作用或发现新的蛋白相互作用奠定基础。

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