山奈酚与水的氢键作用对其抗氧化活性影响的理论研究

祝亚云，潘良军，赵良容，晏名勋，杨昌英

三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室，宜昌443002

黄酮类化合物广泛存在于蔬菜和水果中，是一类抗氧化剂，能捕获自由基，在抑制因自由基氧化引起的细胞衰亡、化学物质分解等过程中起到至关重要的作用。山奈酚(Kaempferol，Kae)作为最常见的黄酮类化合物，主要来源于姜科植物山奈(Kaempferia galang a L.)的根茎，其抗氧化活性已经被证实［1］。此类化合物的抗氧化活性主要来源于多个酚羟基的存在，目前最有效的途径就是酚羟基与有害自由基反应，从而中止有害自由基的链式反应;其次是抗氧化剂通过自身的还原性质，直接给出电子消耗掉有害自由基。有关黄酮化合物抗氧化活性的理论研究有一些报道［2，3］，理论研究主要采用密度泛函(DFT)方法，研究表明，黄酮化合物抗氧化活性的机理可能有三种(如图1)，一是氢原子转移机理(HAT)，清除自由基的能力主要取决于环上羟基发生抽氢反应的难易程度，因此酚羟基O-H 化学键离解能(BDE，bond dissociation energy)是评价其抗氧化活性的重要参数［4］。第二种机理是SPLET，化合物首先去质子化，然后转化为自由基［5］。化合物酚羟基质子解离能力(DPE，deprotonation energy)成为重要因素。第三种机理是电子-质子转移机理［6］，可用分子最高占据轨道能级HOMO 作为化合物给电子能力的理论参数。事实上，由于酚羟基或羰基的存在，黄酮化合物分子内或与溶剂之间会形成氢键，氢键的存在会影响黄酮化合物分子化学键的解离能力或去质子化能力。本文采用计算化学手段，基于DFT 理论，探讨山奈酚与水分子形成的分子间氢键对化合物分子结构、不同位置酚羟基BDE 及DPE的影响，阐述分子间氢键在山奈酚抗氧化活性中的意义，为更深入研究其抗氧化活性机理提供重要依据。

图1 山奈酚生成自由基的两种重要途径Fig.1 Two important routes of Kae radical formation

1 计算原理与方法

首先，用密度泛函理论在(RO)B3LYP/6-31G(2d，2p)水平上对基态分子和相应的自由基﹑去质子化得到的阴离子进行结构优化，RO 指限制性开壳层［7］。并对每一个优化所得结构，用同样的方法作频率分析，以证实它对应着势能面上一个稳定点。然后，在同一水平上，针对每一个优化的结构进行热力学计算(Hessian)，利用电子(进行零点能校正)和热焓的和，得到各结构在气相中298.15 k，1atm 时的热焓，根据Kae-OH→Kae-O· + H· 和Kae-OH→Kae-O-+ H+反应的焓变，得到山奈酚不同位置酚羟基的BDE 和DPE。全部量子化学计算通过GAMESS 软件［8］，在biox.ctgu.edu 计算中心完成。

图2 经过结构优化的山奈酚及其与H2O 氢键复合物的几何构型Fig.2 Optimized structures of Kae and its hydrogen bond complex with H2O molecules

2 结果与讨论

2.1 氢键对化合物几何构型的影响

在B3LYP/6-31G(2d，2p)水平上，对山奈酚分子进行结构优化，结果如图2A。山奈酚不仅A，C环共平面，B 环也几乎在一个平面，二面角仅1.9°。C 环3 位(A3)的-OH 和A 环5 位(A5)的-OH 均与-C=O 形成分子内氢键，A5 位的-OH 与-C =O 之间的氢键键长更短(1.7489Å)，氢键更强。因此本文主要考虑此位点分子间氢键的影响，在同一水平上，对化合物与一个H2O，两个H2O 分子形成的氢键复合物进行结构优化，结果如图2B、C，当H2O 分子在C3 位的-OH 与-C=O 之间时，会拆散两者之间的分子内氢键，C3-OH 与H2O 之间形成分子间氢键(1.7666Å)，但强化了A5 的-OH 与-C =O 之间的氢键，键长进一步缩短(1.6954Å)，此时B 环与AC 环之间的二面角增大(25.8°)，结构发生扭曲。当H2O分子在A5 的-OH 与-C=O 之间时，两个分子内氢键均被大大削弱，键长均达到1.9 Å 以上。进一步研究两个H2O 分子与山奈酚的分子间氢键时发现，两个H2O 分子与C3-OH 与H2O 之间形成分子间氢键簇(图2 D)，同样强化了A5 的-OH 与-C=O 之间的分子内氢键，键长为1.6944 Å，此时B 环与AC 环之间的二面角为15.2°。

可见与H2O 分子形成的分子间氢键会明显影响山奈酚的分子结构及分子内氢键的强度，也会对化合物不同位置酚羟基的反应活性产生影响。

2.2 山奈酚不同位置酚羟基的BDE

可以用抗氧化剂的O-H 键的解离焓(BDE)作为参数来表征不同位置酚羟基氢离域能力。计算中，H 原子的电子能量采用它的精确值-0. 50000 hartree，应用温度校正项5/2 RT，H 原子在298.15 k的焓是-0. 49764 hartree［9］。很明显，化合物O-H BDE 越低，抗氧化剂就越容易把它的羟基氢原子传递给活性氧自由基ROO·，清除自由基的活性越大。

山奈酚不同位置酚羟基抽氢解离能BDE 的计算结果如表1，计算结果与酚酸类抗氧化剂BDE 计算值和实验值结果相近［4］，与槲皮素酚羟基的BDE计算值也在同一范围［2］，证实此计算结果的可靠性。山奈酚A5 的BDE 值最大，达到373.5 kJ/mol，其次是A7，340.9 kJ/mol，B4 与C3 位的BDE 较为接近，分别为319.2、315.9 kJ/mol。可见C3 的酚羟基最为活泼，易发生抽氢反应，B4 的酚羟基次之，较为容易解离出氢，而A5 的酚羟基由于分子内氢键的存在而显得很稳定，难以发生抽氢反应。当山奈酚与H2O 形成分子间氢键时，同样的方法计算不同位置的BDE，结果表明，由于分子间氢键的作用，削弱了各酚羟基O-H 的键强度，使抽氢反应相对变得容易，BDE 普遍降低。其中A5、A7 和B4 位的BDE 降低幅度在10 kJ/mol 以上，而C3 的BDE 变化不大。此时B4 位的BDE 值仅为307.8 kJ/mol，比C3 的BDE 还要低，这是因为分子间氢键削弱了分子的内部稳定性，但H2O 与C3 的分子间氢键对C3 的酚羟基有稳定作用，而B 环的适度扭转有利于B4 的-OH活性发挥，因此B4 位的-OH 变成了抽氢反应的最活泼基团。两个H2O 分子参与时，化合物A5 的BDE 进一步降低到355.6 kJ/mol，该位点氢的解离有利于分子间氢键簇的形成。而其它位置的BDE相对于一个H2O 的情况变化不大，A7 和C3 的BDE略有降低，而B4 的BDE 反而增大4 kJ/mol 左右，这是因为山奈酚与2H2O 形成的氢键复合物中，B 环的扭转角度减小，此时氢解离相对难一些。

表1 B3LYP/6-31G(2d，2p)水平上计算得到的山奈酚及其氢键复合物酚羟基的BDE(298K)Table 1 BDEO-H of Kae and its hydrogen bond complex calculated using B3LYP/6-31G(2d，2p)method

可见，山奈酚与H2O 的分子间氢键作用主要降低A 环两个酚羟基BDE 值，增强其氢的解离能力，而C3 和B4 位酚羟基由于可以通过氢键的相对取向和分子的二面角调节，BDE 值变化不大，但也有一定程度的降低，因此分子间氢键有利于化合物抗氧化活性的发挥。

2.3 氢键对化合物不同酚羟基质子解离能力的影响

SPLET 机制是黄酮化合物发挥抗氧化活性的重要途径，因为大多数黄酮化合物有一定酸性，可以发生去质子化过程，尤其是在极性溶剂中，化合物一定存在一定数量的去质子化形态，因此，化合物去质子化能力与抗氧化活性大小有直接关系。

山奈酚结构中4 个酚羟基去质子化难易程度有明显差别，本文在同一水平上优化化合物去质子化态的结构，利用Hessian 计算单元计算不同结构的H值，得到不同位置酚羟基去质子化能(DPE)，如表2所示。计算过程中，H (H+)=U + pV =5/2RT =1.48 kcal/mol［10］.

表2 B3LYP/6-31G(2d，2p)水平上计算得到的山奈酚及其氢键复合物酚羟基的DPE(298K)Table 2 DPEO-H of Kae and its hydrogen bond complex calculated by using B3LYP/6-31G (2d，2p)method

山奈酚不同酚羟基去质子化活性与抽氢反应活性顺序有明显差异，最明显的区别是C3 位并不是最容易去质子化的位点，B4 和A7 的酸性反而更强，容易发生质子离域反应。A5 位由于分子内氢键的作用，去质子化相当困难，这与第一途径是一致的。与H2O 形成氢键复合物后，A5，A7 及B4 位的去质子化能变化不大，但C3 位DPE 有较为明显的降低。两个H2O 参与时，A5 去质子化变得相对容易，其原因是当A5 位脱掉质子，其中一个H2O 迅速与A5 形成分子间氢键，如图3，从优化后的氢键复合物结构来看，此时氢键键长短，作用强，结构稳定，因此从中性分子变为去质子化态相对容易，DPE 明显降低，与之对应的A7 为DPE 反而增加。C3 位去质子化能力继续降低，与B4 位共同成为质子解离能力较强的位点。

图3 Kae-O-(A5)与两个H2O 形成氢键复合物的结构Fig.3 Optimized structure of complex of Kae-O-(A5)with two H2O molecules

可见，在化合物质子解离过程中，分子内、分子间氢键均会产生影响，主要表现在A5 和C3 位，尤其是考虑的水分子数越多，影响越大。质子解离的难易程度是SPLET 途径的重要影响因素，在动力学上可以认为是决速步骤。因此在进行理论研究时，应该考虑分子内、分子间的氢键作用，分子间氢键通过削弱、破坏分子内氢键，使分子结构发上改变，使酚羟基的抽氢和质子解离更容易发生，提高化合物抗氧化活性。

3 结论

本文通过计算化学探讨了山奈酚与H2O 分子形成的分子间氢键对化合物不同酚羟基BDE、DPE的影响。计算结果表明，山奈酚C3、A5 与-C =O 之间有分子内氢键存在，降低C3、A5 位酚羟基发生抽氢反应和质子解离反应的程度。当山奈酚与溶剂H2O 形成分子间氢键，会使A5 位酚羟基发生抽氢反应和质子解离反应变得更容易，同时也降低C3位质子解离的DPE。总体上对化合物山奈酚发挥抗氧化活性更有利。

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