鸭脂联素基因的单核苷酸多态性研究分析

张引红 李慧芳 朱文奇

（1.山西医科大学实验动物中心，太原 030001；2. 中国农业科学院家禽研究所，扬州 225003）

脂联素（Adiponecyin）是20世纪90年代中期发现的一种脂肪细胞分泌的激素蛋白，并且是迄今为止所发现的唯一与肥胖呈负相关的脂肪细胞因子。脂联素在不同的组织中与不同的受体结合，发挥其特定的生物学功能［1］，如调节能量代谢，抵抗炎症，缓解子宫发育迟缓等功能。脂联素又被称作Axrp30、apM1、AdipoQ和GBP28，属于胶原样血浆蛋白，是脂肪组织高度表达分泌的一种活性物质，其能够影响机体处理糖类和脂肪的能力。最早是由Scherer等［2］从小鼠脂肪组织中发现的，其后陆续从人［3］、猪［4］、鸡［5］、鸭和牛［6］等中获得了脂联素基因，并克隆了该基因的序列。人和哺乳动物脂联素基因包括3个外显子和2个内含子［7］，而禽类由2个外显子和1个内含子组成［5］。人的脂联素基因位于3q27、小鼠位于16号、鸡位于9号染色体上，分别编码244、247和244个氨基酸。目前，已对人和哺乳动物脂联素基因结构功能和基因突变等开展了大量的研究工作，已发现该基因在人上至少存在11个突变位点，该基因启动子和内含子的C/EBP转录因子在脂肪细胞分化和调控脂联素基因的表达起重要作用［8］。但是对禽类脂联素基因的研究较晚，相关研究报道较少。

连接酶检测反应（Ligase detection reaction，LDR）是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。通过多重PCR （Multiplex PCR）获得含有待检测突变位点的基因片段，高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行，最后通过测序仪电泳读取检测结果。该技术属于中、低通量的SNP分型技术，较RFLP、SSCP方法具有特异性高、检测快速、准确率高、适用范围广等优点，较DNA测序SnaPshot和HRM成本低廉等优点。本试验运用PCR-LDR方法检测7个鸭种脂联素基因的遗传多态性，分析该基因T523C SNP位点在不同品种鸭中的遗传变异情况，旨在为这7个品种鸭的分子标记辅助选育工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

56只莆田黑鸭、51只连城白鸭、46只绍兴鸭、56只攸县麻鸭、58只建昌鸭、50只北京鸭及80只高邮鸭的血样均采自各国家级保种场。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 鸭翅静脉采血，ACD抗凝，酚/氯仿/异戊醇法抽提基因组DNA，TE溶解后-20℃保存。琼脂糖凝胶电泳初步检测后，测定DNA浓度及纯度OD260/OD280。

1.2.2 PCR-LDR检测 根据GenBank的鸭Adiponectin基因序列（DQ452618），针对SNP位点，采用Primer Premier5.0 和Oligo 6.0软件设计特异性引物。上游引物Adiponectin T523C-up：5'-ACTCTGTCCCCCAGGTTTG -3'，下游引物Adiponectin T523C-low：5'-AGTAGTAGGTGCCGGGGATG -3'。PCR反应体系为20 μL，其中包括：50 ng/μL模板1.0 μL，1×Buffer缓 冲 液2.0 μL，3 mmol/L Mg2+0.6 μL，2 mmol/L dNTPs 2 μL，1U Taq DNA 聚合酶0.2 μL，1×Q-Solution 4.0 μL，0.5 pmol/L引物混合液2 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反应条件为：95℃ 预变性15 min；94℃ 变性30 s，53℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。用3% 的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确定其作为模板在LDR反应中加入的量。

根据LDR探针设计原则［9］设计LDR的上下游探针，上游探针5'端用磷酸化修饰（表1）。在PCR扩增产物中加入等体积ddH2O稀释，作为连接反应的模板。LDR反应体系为：1×Buffer 1 μL，12.5 pmol/L Probe Mix 1 μL，2 U连接酶0.05 μL，100 ng/μL PCR产物1 μL，去离子水6.95 μL。LDR反应条件为：94℃ 变性2 min；94℃ 30 s，60℃ 2 min，35个循环。

表1 LDR检测探针序列信息

1.2.3 基因分析 取1 μL LDR连接产物与1 μL ABI GS-500 ROX荧光标记分子量标准和1 μL去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2 min，冰中骤冷，于5% 聚丙烯酰胺和5 mol/L 尿素中3 000 V电泳2.5 h，应用GENESCANTM672软件分析胶文件，进行数据收集、泳道线校正、数据转换、内在分子量标准校正、迁移片段大小测量；应用Gen-mapper软件进行数据分析和基因分型。

1.2.4 数据统计与分析 利用Excel 统计7个鸭种Adiponectin基因每种基因型的数量，运用SPSS13.0软件统计分析基因频率和基因型频率，并检验群体内基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 结果

2.1 PCR产物扩增结果

Adiponectin基因PCR产物片段大小为286 bp与设计的片段大小一致（图1）。

2.2 LDR检测Adiponectin基因型

Adiponectin基因T523C经LDR检测，均显示为3种峰图（图2），即有3种基因型TT、CC和TC。基因分型标准为Adiponectin基因连接产物检测出双峰（86±0.5）bp /（88±0.5）bp为TC基因型，单峰（86±0.5）bp为TT基因型，单峰（88±0.5）bp为CC基因。

图1 Adiponectin基因PCR产物

图2 Adiponectin-T523C基因分型截图

2.3 Adiponectin基因频率、基因型频率及Hardy-Weinberg平衡分析

由表2可见，7个鸭种均有3种基因型：TT、TC和CC。在莆田黑鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、建昌鸭、北京鸭和高邮鸭中，杂合型占优势，仅在连城白鸭中，TT型占优势。莆田黑鸭、连城白鸭、攸县麻鸭和北京鸭等位基因T的频率大于等位基因C的频率，绍兴鸭、建昌鸭和高邮鸭等位基因C的频率大于等位基因T的频率。7个鸭种在Adiponectin基因T523C位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。

3 讨论

表2 Adiponectin基因及基因型频率分布

目前，关于动物脂联素基因的研究主要集中在该基因与动物体内脂肪沉积、动物生长发育相关的研究，本试验采用PCR-LDR方法对莆田黑鸭、连城白鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、建昌鸭、北京鸭和高邮鸭等不同鸭种的Adiponectin基因T523C位点单核苷酸多态性分析结果表明，仅在连城白鸭中，TT型占优势。在长期的人工选择与选配过程中，地方品种在某些基因座上就会渐渐地趋于纯合并固定，表现为品种的保守性，而另外一些受选择压力相对较小的基因座则可能表现出更丰富的多态性，表现为品种的变异性。品种的保守性和变异性往往反映了它区别于另一个品种的种质特征。李慧芳等［10］对鸭的生长素基因的多态性做了分析，在所发现的3个突变位点中，连城白鸭在这3个位点均与其他8个鸭品种有明显的差异。这是否与连城白鸭独特的种质特征有关，还有待进一步分析研究。

不同鸭种Adiponectin基因在523位点处均发生了T→C的突变，这与董飚等［11］的研究结果相一致。家禽脂联素基因相关的研究报道甚少，刘大林等［12］在京海黄鸡脂联素基因内含子发现C1251T突变（AY786316），该位点对腹脂重有显著的遗传效应；董飚等［l1］发现，家鸭脂联素基因存在7个单碱基突变；张依裕等［13，14］对鸭脂联素基因SNP多态与鸭肌内脂肪等指标的关联分析提示，脂联素基因对白羽番鸭的脂肪沉积起重要作用。但此突变位点是否会影响基因的表达还需进一步研究。

从基因型频率的分布情况来看，本试验中7个鸭种在T523C突变位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05），说明该位点从基因序列保守性来说比较强，在品种的选育、迁徙和遗传漂变等因素作用下处于动态平衡当中，它们的遗传是随机的，基因频率的平衡对于群体稳定性有着直接的保证作用。再者，国内鸭品种选育程度都不高，所以7个鸭种在T523C突变位点均出于遗传平衡状态。

4 结论

鸭Adiponectin基因T523C位点的多态性进行检测与分析表明，7个鸭种均有3种基因型；连城白鸭中TT型占优势，其他品种中均为杂合型占优势；莆田黑鸭、连城白鸭、攸县麻鸭和北京鸭等位基因T的频率大于等位基因C的频率，而其他品种与其相反；7个鸭种在此位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡状态。

［1］ Ding ST, Liu BH, Ko YH. Cloning and expression of porcine adiponectin and adiponeetin receptor 1 and 2 genes ［J］. J Anim Sci, 2004, 82（11）：3162-3174.

［2］ Scherer PE, Williams S, Fogliano M, et al. A novel serum protein similar to Clq, produced exclusively in adipocytes［J］. J Biol Chem, 1995, 270（45）：26746-26749.

［3］ Maeda K, Okubo K, Shimomura I, et al. cDNA cloning and expression of a novel adipose specific collagen-like factor, apM1（Adipose most abundant gene transcript1） ［J］. Biochem and Biophys Res Commun, 1996, 221（2）：286-289.

［4］ Yin HF, Zhao ZH, Fan BL, et al. cDNA cloning, genomic structure, chromosomal mapping, and expression analysis of parotid secretory protein in pig ［J］. Genomics, 2004, 83（1）：9-18.

［5］ Yuan J, Liu W, Liu ZL, et al. cDNA cloning, genomic structure, chromosomal mapping and expression analysis of ADIPOQ（adiponectin）in chicken ［J］. Cytogenetic and Genome Research, 2006, 112（1-2）：148-151.

［6］ 丛立新, 李鹏, 闫峰, 等.牛脂联素cDNA全基因序列的克隆［J］.安徽农业科学, 2009, 37（17）：7895-7896, 7931.

［7］ Takahashi M, Arita Yamaqata K, Matsukawa Okutomi K, et al. Genomic structure and mutations in adipose-specific gene, adiponectin ［J］. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders, 2000, 24（7）：861-868.

［8］ Saito K, Tobe T, Yoda M, et al. Regulation of gelatin-binding protein 28（GBP28）gene expression by C/EBP ［J］. Biol Pharm Bull, 1999, 22（11）：1158-1162.

［9］ 刘华贵, 王小花, 刘玉方, 等.五个鸡群中催乳素基因密码子使用频率与产蛋量的关系分析［J］.生物化学与生物物理进展, 2007, 34（10）：1101-1106.

［10］ 李慧芳, 朱文奇, 徐文娟, 等.鸭生长素基因单核苷酸多态性分析［J］.江苏农业学报, 2009, 25（3）：576-582.

［11］ 董飚, 龚道清, 孟和, 等.鸭脂联素基因单核苷酸多态性检测及群体遗传分析［J］.遗传, 2007, 29（8）：995-1000.

［12］ 刘大林, 俞亚波, 魏岳, 等.脂联素基因对京海黄鸡体重及屠体性状的遗传效应［J］.扬州大学学报：农业与生命科学版, 2009, 30（1）：31-34.

［13］ 张依裕, 徐琪, 段修军, 等.白羽番鸭脂联素基因内含子多态与肉质的关联分析［J］.河南农业科学, 2010（7）：97-109.

［14］ 张依裕, 徐琪, 段修军, 等.白羽番鸭脂联素基因SNP与肌内脂肪和血清总胆固醇的关联分析［J］.中国畜牧杂志, 2011, 47（3）：6-9.