HPLC 法测定茶叶中儿茶素及咖啡碱*

周顺珍，龚雪，周国兰，郭灿，郑文莉

（贵州省茶叶研究所，贵阳 550006）

茶叶中所含的多酚类物质是一种以儿茶素为主体的酚类化合物，是茶多酚的主体成分，儿茶素约占茶多酚总量的65%～80%,主要包括没食子酸（GA）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素（EC）、儿茶素（+C）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子基儿茶素没食子酸酯（GCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）等。开发和利用天然抗氧化剂已经成为当今世界食品药品科技发展的方向。儿茶素作为一种重要的抗氧化剂，主要用于抗癌、抗肿瘤、清除人体自由基，还可用于防止龋齿、抑菌等。研究发现EGCG 在体内外对许多肿瘤细胞增殖具有抑制作用［1］。目前测定儿茶素组分的首选方法为高效液相色谱（HPLC）法［2–6］。我国现行检测茶叶中儿茶素组分及咖啡碱（CAF）的最新国家标准GB／T 8313–2008［7］也是HPLC 法，该法采用甲醇多次提取法对样品进行前处理，操作繁琐，流动相组成复杂，样品分析时间过长，所需试剂和仪器多且昂贵。

笔者采用水提法进行样品浸提，并与GB／T 8313–2008 进行比较，结果表明所建立的方法操作简单，成本低，效率高，使用范围广，能同时测定7 种儿茶素组分及咖啡碱，效果较好。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent1260 型，美国安捷伦科技有限公司；

电子天平：BSA224S–CW 型，北京赛多利斯科学仪器有限公司；

恒温水浴锅：HH·SY21–Ni8 型，北京长源实验设备厂；

抽滤装置：2XZ–0.5 型，浙江黄岩黎明实业公司；

超纯水制备器：TST–RO–20 型，石家庄泰斯特仪器设备有限公司；

数控超声清洗器：KQ5200DE 型，昆山市超声仪器有限公司；

离心机：TGL–20bR 型，上海安亭科学仪器厂；

快速混匀器：SK–1 型，金坛市杰瑞尔电器有限公司；

甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、乙睛：均为色谱纯；

乙酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、抗坏血酸：均为分析纯；

GA，CAF，EGC，+C，EC，EGCG，GCG，ECG混合对照品：国家植物功能成分利用工程技术研究中心／教育部茶学重点实验室；

各儿茶素组分及咖啡碱对照品：纯度均不小于98%，北京世纪奥科生物技术有限公司；

实验用水为纯净水。

1.2 色谱条件

色 谱 柱：C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱温：35℃；紫外检测器波长：278 nm ；流动相：A 相（超纯水），B 相（N,N-二甲基甲酰胺︰甲醇︰冰乙酸=40︰2︰1.5）；流动相流速：1.0 mL／min；进样量：5 μL。

1.3 对照品溶液的配制

精 密 称 取GA，CAF，EGC，+C，EC，EGCG，GCG，ECG 混合对照品适量，加纯净水配制成分别含9.71 μg／mL GA，101.97 μg／mL CAF，81.09 μg／mL EGC，7.35 μg／mL +C，64.23 μg／mL EC，400.16 μg／mL EGCG，7.27 μg／mL GCG，91.83 μg／mL ECG 的混合对照品溶液。

1.4 供试品溶液的制备

取部分水提取液（GB／T 8305–1987）［8］过0.45 μm 水系微孔滤膜。在1.2 色谱条件下进行测定。采用保留时间识别各目标组分，以外标法确定相应组分的浓度。

2 结果与分析

2.1 色谱图

在1.2 色谱条件下取供试品溶液5 μL 进样，记录色谱图。GB／T 8305–1987 水提取法色谱图如图1 所示。

图1 本法供试品色谱图

按照GB／T 813–2008 甲醇提取法进行样品处理后进样分析（不含GCG），供试品的色谱图如图2 所示。图2 表明，甲醇提取法样品中的EGCG 与EC 不能有效分离。

图2 国标方法供试品色谱图

2.2 线性回归方程和相关系数

分别精密吸取混合对照品溶液2.5，5.0，7.5，10，12.5 和15 μL［9］，按1.2 色谱条件进样测定，同一体积的样品平行分析3 次，取其平均值。以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μL）为横坐标作图，得到各组分的线性回归方程如表1。由表1 可知，当对照品溶液进样量在2.5～15 μL，GA，CAF，EGC，DL-C+C，EC，EGCG，GCG 和ECG 8 种组分的进样量分别在0.024 3～0.145 6，0.254 9～1.529 6，0.202 7～1.216 4，0.018 2～0.110 2，0.160 6～0.963 4，1.000 4～6.002 4，0.018 2～0.109 0，0.229 6～1.377 4 μg范围内与色谱峰面积的线性关系良好，相关系数r为0.991 0～0.999 9。

表1 线性回归方程和相关系数

2.3 加标回收率及精密度

吸取9 份已知含量的绿茶提取液各1 mL，分为3 组，每组3 份。分别加入混合对照品溶液0.5，1.0，1.5 mL，按实验方法进行测定，计算GA，CAF，ECG，+C，EC，EGCG，GCG 和ECG 的含量，计算各组分的回收率及精密度，结果见表2。由表2可知，所有组分的回收率在98.60%～100.17%之间，测定结果的相对标准偏差（RSD)均小于0.48%，说明该方法重现性良好，检测结果可靠，满足检测要求。

表2 回收率及精密度试验结果（n=3）

2.4 样品测定

取同一批号样品6 份，分别在1.2 色谱条件下及按照国标方法进行6 次平行测定，取平均值作为测定结果，见表3。

由表3 可知，与现行标准方法相比，水提取法测定结果的相对偏差在0.47%～5.55%之间。另外，水提法有部分脂溶性儿茶素不能完全溶出，而GB／T 8313–2008 甲醇提取法EGC，EGCG 和ECG 的含量相对较高；GA 和+C 测定结果差别不大，在误差范围内；用70%的甲醇溶液提取，虽然提取完全，但提取液中含有大量的叶绿素，进行液相色谱检测时泵压明显增大，对色谱柱污染严重，使柱寿命缩短；甲醇提取法样品中的EGCG 和EC 不能分离，对色谱柱的要求较高；甲醇提取法操作也较繁琐，有机溶剂用量较大，不利于环保和节约成本。用水提取样品不仅能达到较好的提取效果，且可以直接利用水浸出物的提取液，无需重新浸提，步骤简便，成本较低。

表3 两种提取方法的测定结果（n=6） %

3 结语

用水浸出方式提取绿茶样品，HPLC 法测定茶叶中的儿茶素和咖啡碱，操作简便，结果准确。

［1］ Milligan S A，Burke P，Coleman D T，et al. The green tea polyphenol EGCG potentiates the antiproliferative activity of Met and epidermal growth factor receptor inhibitors in nonsmall cell lung cancer cells［J］. Clin Cancer Res，2009，15(15): 4 885–4 894.

［2］ 邓永亮，冯雷，吕有才.一种快速检测茶叶中儿茶素的HPLC 方法［J］.西南农业党学报，2011，24(3): 932–935.

［3］ 侯冬岩，回瑞华，李铁纯.高效液相色谱法对绿茶中茶多酚含量测定［J］.食品科学，2010，31(24): 307–307.

［4］ 何昱，洪筱坤，五智华.HPLC 法测定茶叶中儿茶素类咖啡因的含量［J］.药物分析杂志，2007，27(2): 197–200.

［5］ 廖夫生.HPLC 法同时测定茶叶中4 种称茶素成分［J］.中国茶叶，2008(9): 24–25.

［6］ 戴军，王洪新，陈尚卫，等，茶叶及茶多酚中儿茶素的高效液相色谱分析方法的研究［J］.色谱，2001，19(5): 398.

［7］ GB／T 8313–2008 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法［S］.

［8］ GB／T 8305–1987 茶水浸出物测定［S］.

［9］ 刘臣，张雷，刘婧，等，反相高效液相色谱法同时测定碧螺春茶中4种儿茶素类化合物及咖啡因含量［J］.安微农业科学，2012，40(12): 7 425–7 427.