ERα通过MTA3调控EMT影响HCC细胞凋亡的研究

张宇华 胡智明 张成武 吴伟顶 刘 杰 尚敏杰 赵大建

肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)病死率高，每年全球50万以上患者诊断为原发性肝癌，HCC约占原发性肝癌的85%［1］。我国是HCC高发区，发病人数约占全球55%，在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，手术治疗是目前治疗效果最佳、唯一有可能治愈的方案，但是5年内再次发现肿瘤的概率为75%［2］。进展期肝癌目前无有效治疗方案，放化疗对HCC无效。分子靶向治疗是目前发展十分迅速的一个领域，但索拉菲尼是一种小分子多激酶抑制剂，仅能使37%患者延长生存期2～3个月［3］。雌激素在HCC发生发展中起作用，但目前对此方面的研究不多。上皮间质转换(epithelial－mesenchymal transition，EMT)为目前肿瘤研究的热点，影响多种肿瘤的转移及进展，而雌激素受体 α(Estrogen receptorα，ERα)通过调控 Snail、E－cadherin(EMT重要调控因子)调控EMT已经在乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌等中被证实，但在HCC中，目前尚未发现有关ERα调控EMT的报道。笔者通过检测雌二醇、氟维司琼作用于HCC细胞后 MTA3、Snail、E－cadherin和 BAX表达变化，明确 ERα通过 ERα→MTA3→Snail→E－cadherin信号通路影响 HCC细胞 EMT，进而影响HCC细胞凋亡的机制，为针对ERα的治疗应用于HCC提供理论基础。

材料与方法

1．HCC细胞:HCC 细胞株:HepG2、SMMC －7721(中国医学科学院肿瘤细胞库)。

2．细胞培养:HepG2、SMMC－7721细胞于DMEM培养基(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素)(杭州四季青)37℃、5%CO2常规培养。

3．Western blot:按照常规方法提取细胞总蛋白、定量。蛋白变性后10%SDS－聚丙烯胶收集+5%SDS－聚丙烯胶分离，蛋白湿转至 PVDF 膜，脱脂奶封闭后，ERα、MTA3、Snail、E－cadherin、BAX(Santa Cruz Biotechnology公司)4℃振荡孵育过夜，二抗(抗兔或抗鼠IgG，Santa Cruz Biotechnology公司)室温孵育1h，ECL显色。β－actin(Santa Cruz Biotechnology公司)作为内参照。

4．分组及干预药物浓度:HepG2、SMMC－7721细胞在无酚红培养液中调节细胞浓度为2．0×106个/毫升。空白对照组无酚红培养液培养;药物干预组浓度:雌二醇(Sigma，德国)浓度:10－9mol/L、10－8mol/L、10－7mol/L、10－6mol/L;氟维司琼(Sigma公司，德国)浓度:10－9mol/L、10－8mol/L、10－7mol/L、10－6mol/L。药物干预48h后测定各目标基因的相对浓度。

5．引物设计:采用Primer 5．0引物设计软件和引物设计原则进行引物的设计，然后由上海生物工程有限公司负责合成:引物序列:ERα:SE:5'－AATgATTCTATAATgCCATCATg-CAgC －3'，AS:5'－gCTTggTTAAACATATCTgCAAggTTAC －3';MTA3:SE:5'－TgAggCTgAggAggAggC －3'，AS:5'－CTTCTATCCTTCTTATTAggTATgggTTgC－3';Snai:SE:5'－gAggCggTggCAgACTAg－3'，AS:5'－gACACATCggTCAgACCAg－3';E－cadherin:SE:5'－gAATCCAAAgCCTCAggTCA －3'，AS:5'－TgTAgTCACCCACCTCTAAg－3';BAX:SE:5'－AACTggACAgTAACATgg－3'，AS:5'－CTTATAgACCACATCTgA －3';β－actin:SE:5'－gATgCTgCTTACATgTCTCg－3'，AS:5'－CCAgCAgAgAATggAAAgTC －3'。

6．PCR反应条件:Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测RNA纯度和浓度。cDNA合成:用反转录酶合成cDNA，按试剂盒操作。实时定量PCR反应参数:95℃，5min;95℃，20s;55℃，20s;72℃，30s;共35个循环。所有实验重复3次。PCR产物以曲线起翘值(Ct值)作为分析依据。在ABI7500软件体系中调整基线和阈值，读出各反应孔Ct值。以β－actin作为内对照。根据靶基因及β－actin基因Ct值计算△Ct进行分析，△Ct=2^(β－actin基因的Ct值－靶基因的Ct值)，△Ct值越高，表达越低。

7．统计学方法:SPSS 13．0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，统计学分析用独立样本t检验，P＜0．05表示差异有统计学意义。

结 果

1．HCC 细胞中 ERα、MTA3、Snail、E －cadherin、BAX在基因和蛋白层面的表达:从图1可以发现HepG2细胞有 ERα表达，而 SMMC－7721细胞基本无 ERα 表达;MTA3、Snail、E －cadherin、BAX 在两个细胞株中均有表达，MTA3在两个细胞株中表达无明显差异;HepG2细胞中Snail表达低，E－cadherin表达高;而SMMC－7721细胞中Snail表达高，E－cadherin表达低;BAX在两株细胞中无明显差异。

图1 ERα、MTA3、Snail、E －cadherin、BAX 在 HCC细胞株HepG2、SMMC－7721中的表达

2．Real－time PCR法:检测HCC细胞经过雌二醇、氟维司琼作用后，MTA3、Snail、E －cadherin和BAX mRNA的表达水平的变化。HCC细胞株HepG2和SMMC－7721经不同浓度雌二醇、氟维司琼作用48h后，MTA3基因表达的变化。HepG2细胞经过不同浓度雌二醇处理后，随着雌二醇浓度升高，MTA3基因△Ct下降，表达升高，各组间表达有统计学意义(P＜0．05，图2A)，而 SMMC －7721细胞 MTA3则无明显统计学意义。HCC细胞经过不同浓度氟维司琼作用48h后，随着浓度升高，HepG2细胞MTA3表达下降(P＜0．05，图2B)，而 SMMC －7721细胞 MTA3表达改变无统计学差异(图2)。HCC细胞株HepG2和SMMC－7721经不同浓度雌二醇、氟维司琼作用48h后，Snail基因表达的变化。HepG2细胞经过不同浓度雌二醇处理后，随着雌二醇浓度升高，Snail基因△Ct上升，表达下降，各组间表达有统计学意义(P＜0．05，图3A)，而 SMMC －7721细胞 MTA3 则无明显统计学意义。HCC细胞经过不同浓度氟维司琼作用48h后，随着浓度升高，HepG2细胞Snail表达上升(P＜0．05，图3B)，而 SMMC －7721 细胞 Snail表达改变无统计学差异(图3)。HCC细胞株HepG2和SMMC－7721经不同浓度雌二醇、氟维司琼作用48h后，E－cadherin基因表达的变化。HepG2细胞经过不同浓度雌二醇处理后，随着雌二醇浓度升高，E－cadherin基因△Ct下降，表达升高，各组间表达有统计学意义(P＜0．05，图 4A)，而 SMMC－7721细胞 E－cadherin则无明显统计学意义。HCC细胞经过不同浓度氟维司琼作用48h后，随着浓度升高，HepG2细胞E －cadherin表达下降(P ＜0．05，图4B)，而SMMC－7721细胞E－cadherin表达改变无明显统计学差别(图4)。HCC细胞株HepG2和SMMC－7721经不同浓度雌二醇、氟维司琼作用48h后，BAX基因表达的变化。HepG2细胞经过不同浓度雌二醇处理后，随着雌二醇浓度升高，BAX基因△Ct下降，表达升高，各组间表达有统计学意义(P＜0．05，图 5A)，而SMMC－7721细胞BAX则无明显统计学意义。HCC细胞经过不同浓度氟维司琼作用48h后，随着浓度升高，HepG2细胞BAX表达下降(P ＜0．05，图5B)，而SMMC－7721细胞BAX表达改变无明显统计学差别(图5)。

图2 雌二醇和氟维司琼处理HepG2和SMMC－7721细胞后经real－time PCR检测后MTA3基因表达(△Ct)的变化

讨 论

HCC总体治疗效果仍不满意。手术治疗是目前治疗效果最佳、唯一有可能治愈的方案，但是5年内肿瘤复发率为75%［2］。进展期肝癌目前无有效治疗方案，全身化疗对HCC无效。分子靶向治疗是目前发展十分迅速的一个领域，索拉菲尼是一种低分子多激酶抑制剂，2007年FDA批准可使用于不能切除的晚期肝癌，与安慰剂相比，能使37%患者延长生存期2 ～3 个月［3］。其他尚有 brivanib、erlotinib、bevacizumab等分子靶向药物正进行临床研究，尽管目前HCC分子靶向治疗发展十分迅速，但进展期肝癌总体疗效不佳。

图3 雌二醇和氟维司琼处理HepG2和SMMC－7721细胞后经real－time PCR检测后Snail基因表达(△Ct)的变化

图4 雌二醇和氟维司琼处理HepG2和SMMC－7721细胞后经real－time PCR检测后E－cadherin基因表达(△Ct)的变化

图5 雌二醇和氟维司琼处理HepG2和SMMC－7721细胞后经real－time PCR检测后BAX基因表达(△Ct)的变化

EMT是目前肿瘤研究的热点之一，EMT能使肿瘤细胞侵袭力更强，恶性程度更高，耐药性更强，预后更差，抑制EMT也是下一步肿瘤治疗的关键之一［4］。肝细胞虽不是上皮细胞，但其表现出极性并相互粘连，呈现上皮细胞特性。已有大量文献证实EMT在肝脏疾病发生发展过程中起重要作用，EMT被认为是从肝硬化向肝癌转移的桥梁，EMT指标能在肝硬化中发现，并在肝癌患者中表达增强，而在HCC伴转移的患者中表达最强［5，6］。目前已证实Snail为EMT中最重要的调控因子，Snail表达升高预示 EMT 被激活［4，7］。而 E －cadherin 是 Snail下游受体，受 Snail抑制，E－cadherin被认为是 EMT的直接调控因子，E－cadherin表达下降提示EMT被激活［4，8］。

雌激素在肝癌发生发展过程中起作用，男性HCC发病率明显比女性高，约为3～5倍，在动物实验中也发现类似的情况，使用二乙基亚硝胺诱导小鼠HCC，在雄性小鼠中100%诱导而雌性小鼠中仅10%～30%诱导成功［9］。以上结果提示雌激素在HCC发生发展中起作用，能抑制HCC的发生进展，但目前对此机制的研究不多。Nakatani等［10］和Naugler等［11］发现雌激素能通过抑制白介素6抑制二乙基亚硝胺诱导的肝损害，并抑制HCC在雄性小鼠中的发展。ERα通过Snail、E－cadherin调节EMT在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等激素密切相关的肿瘤中均被发现，ERα 高表达抑制 EMT，改善肿瘤预后［12］。但笔者未发现ERα在HCC中调节EMT相关的报道。

笔者首先在HCC细胞中通过RT－PCR及Western blot显示 MTA3、ERα、Snail、E －cadherin、BAX 在HCC细胞中存在并表达，结果提示ERα→MTA3→Snail→E－cadherin信号通路中各个因子在HCC细胞中存在。在 HepG2细胞中，ERα表达明显高于SMMC－7721(图1)。然后笔者通过雌二醇激活ERα后，real－time PCR发现在ERα高表达的HepG2细胞中，MTA3表达上升，Snail表达则受抑制、E－cadherin表达上调(P＜0．05)，EMT被抑制。而在ERα低表达的SMMC－7721细胞中，则没有明显改变。通过氟维司琼处理后，HepG2细胞MTA3表达下降，Snail表达上升、E－cadherin表达下调(P＜0.05)，EMT被激活(图2)。笔者得到的结果与Fujita等［12］在乳腺癌细胞中获得的结果类似，雌二醇可以通过激活ERα，抑制 Snail，激活E－cadherin而抑制EMT，而氟维司琼则可以起到相反的作用。然后笔者又检测了凋亡相关因子BAX的表达，ERα激活后，EMT被抑制，BAX表达增加，肿瘤细胞凋亡激活，而通过氟维司琼抑制ERα后，EMT被激活，BAX表达降低，细胞凋亡被抑制。本研究实验结果提示在ERα高表达的肝癌细胞株中，雌激素可以通过激活ERα，激活 MTA3，抑制 Snail，激活 E －cadherin，从而抑制这些HCC细胞株的EMT，同时激活了肿瘤细胞的凋亡。这个结果解释了雌激素在部分HCC的发生发展过程中起到一定的抑制HCC生长发展的作用，与其他学者所报道的ERα在HCC发展中的角色相符［9～11］。但HCC发展，特别是进展期HCC的发展过程往往是一个多基因调控的过程，本结果仅提示了在部分ERα表达阳性的HCC中，ERα可以作为一个潜在的治疗靶点。

通过以上结果，笔者认为ERα→MTA3→Snail→E－cadherin信号通路在部分HCC细胞中存在并调控EMT，与肿瘤凋亡相关。在ERα高表达的HCC细胞中，ERα可以作为一个靶点对此通路进行干预。雌二醇通过激活ERα进而抑制EMT，激活肿瘤凋亡，抑制HCC的发展，而氟维司琼则可以起到相反的作用。本结果拓展了HCC治疗的思路，在HCC细胞中证明了雌二醇抑制EMT的机制，下一步需要在体内实验中进一步验证。

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