人LTF基因真核表达载体的构建

单文姣　郝一　郭晨微　肖亮亮　洪艳　钟韵

【摘 要】LTF基因表达产物乳铁蛋白为一种多功能糖蛋白，其具有调节免疫，抗炎、抗微生物、抗肿瘤等多种生物学功能。LTF在鼻咽癌中表达下调，但其在鼻咽癌中的功能尚未完全明确。为探讨LTF与鼻咽癌的关系，本研究以人cDNA为模板， PCR扩增LTF全长开放读码框，再将其定向插入真核表达载体， 测序鉴定序列和插入方向正确。LTF真核表达载体成功构建，为进一步探索LTF基因在鼻咽癌细胞内的功能奠定基础。

【关键词】真核表达载体；LTF；载体构建

乳铁蛋白（Lactoferrin， LTF） 是一种铁结合性糖蛋白，具有广泛的生物学活性。它不仅参与体内铁的转运及代谢、机体免疫调节，还具有抗炎症、抗微生物及抗肿瘤等活性。

鼻咽癌的发生是多因素、多阶段、多步骤的过程，遗传因素是其发生的重要因素之一。研究显示，LTF在慢性鼻咽炎中表达正常，在鼻咽癌中表达下调[1]，提示LTF可能是鼻咽癌候选抑瘤基因。本实验构建了LTF 基因真核表达载体为进一步进行LTF 基因体内外功能研究奠定了基础。

一、材料和方法

（一）菌株和载体

E.Coli DH5α菌株；pMD18-T载体 （Takara）是一种高效克隆PCR产物（专用载体，有 Ampr 抗性；pcDNA3.1（-）载体（Invitrogen）含CMV启动子，具有Ampr和Neor抗性，在真核细胞中高效表达。

（二）试剂

高保真聚合酶（LATaq， Takara）；HindIII、XbaI等内切酶、T4 DNA Ligase（Fermentas）；质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒（Qiagen）；逆转录试剂盒（Promega）。

（三）方法

（1）引物设计和酶切位点分析

（1）LTF基因ORF引物设计 LTF mRNA序列（NM_002343.2），ORF扩增引物（目的片段2171bp），上游：5'-CGCCTCCAGACCGCAGACATGAAACTT-3'；下游：5'-CTGGGCCATCTTC TTCGGTT TTACTTC-3'。GAPDH引物（目的片段550 bp），上游：5'-CCACCCATGGCA AATTCCTCCATGGCA-3'；下游：5'-TCTAGACGGCA GG TCAGGTCCACC-3'。

（2）酶切位点分析 Webcutter 2.0分析LTF序列，结合pMD18-T和pcDNA3.1（-）载体特点，选用HindIII和XbaI作为多克隆位点。

（2） RT-PCR扩增LTF基因ORF

慢性鼻咽炎组织总RNA抽提，两步法RT-PCR获得cDNA。

（3）目的片段与克隆载体连接

（1）PCR产物与pMD18-T 载体连接：PCR纯化产物 4μL，pMD18-T 1μL，缓冲液 5μL，补ddH2O至50 μL，16 ℃ 20 h。

（2）连接产物转化及鉴定：①质粒转化，菌落PCR鉴定。②质粒抽提和鉴定：挑阳性克隆培养，试剂盒抽提。③鉴定：a. HindIII/XbaI双酶切。b. 测序鉴定。

（4）LTF真核表达载体的构建

（1）目的片段插入真核表达载体：取质粒pMD18-T/LTF和pcDNA3.1（-），分别Hind III/Xba I双酶切，回收目的片段，体外连接，体系如下：10×buffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL，LTF目的片段 3μL，pcDNA3.1（-）线性片段1μL，加ddH2O至20μL，15 ℃ 18 h，65 ℃ 10 min。连接产物转化DH5α感受态。

（2）阳性克隆鉴定：方法同前。

二、实验结果

（一）以cDNA为模板扩增LTF基因ORF

RT-PCR方法从慢性鼻咽炎组织cDNA中克隆LTF基因ORF。PCR产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳显示片段大小正确（约2.2kb）（图1）。

图1 RT-PCR扩增LTF ORF（0.8%琼脂糖凝胶）

M：DL2000；Lane1-2：慢性鼻咽炎组织（GAPDH：550bp，LTF ORF：2171bp）。

（二）LTF基因ORF TA克隆载体的构建

PCR扩增的LTF基因 ORF产物进行TA连接、转化，挑Amp阳性克隆，PCR鉴定，第1-5号克隆可扩增出目的片段（图2A）。挑第5号克隆抽质粒，HindIII/XbaI双酶切，酶切产物电泳（图2B）。测序鉴定显示LTF基因ORF序列正确，并正向连接到pMD18-T载体。重组质粒命名为pMD18-T/LTF。

图2 LTF基因TA菌落克隆PCR和质粒HindIII/XbaI双酶切鉴定（0.8 %琼脂糖凝胶）

M：DL2000；图2A Lane1-5为5个TA克隆菌落PCR（LTF：207bp）；

图2B中Lane1-3为阳性TA克隆HindIII/XbaI双酶切（2.6kb/2.2kb）。

（三） LTF真核表达载体鉴定

HindIII/XbaI双酶切pMD18-T/LTF载体，回收LTF序列并体外连接到pcDNA3.1（-）上，转化、挑克隆，送菌液用T7通用引物测序（图3）。测序结果blastn证明连接方向正确。构建的LTF真核表达载体重命名为pcsLTF。

图3.pcsLTF用T7通用引物测序

三、讨论

LTF基因定位于3p21.3，其表达产物乳铁蛋白分子量约为80kDa。LTF是非特异性免疫的重要组成部分，能对各种生理环境的变化做出应答。LTF具有抗肿瘤作用，其表达下调或缺失是肿瘤发生的重要因素。

LTF抗肿瘤机制如下：①降低化学致癌物诱导的癌变。动物实验表明饮食添加乳铁蛋白能抑制化学物致癌物诱导等肿瘤发生。LTF通过调节I和II相代谢酶活性，参与致癌物解毒过程，阻断肿瘤发生。②调节肿瘤免疫作用。LTF能活化NK细胞；增强单核巨噬细胞的吞噬功能；刺激白介素、IFN-γ和TNF-α等细胞因子释放；增强CD4、CD11、LFA-1、ICAM-1等细胞因子受体表达[2]。③抑制肿瘤血管生成：LTF可抑制血管内皮细胞生长因子 （VEGF）形成，诱导抗血管生成因子IL-18、INF-γ等[3]产生。④抑制肿瘤增殖。在乳腺上皮癌细胞中， LTF可通过P53非依赖性机制上调P21 蛋白表达；头颈部肿瘤细胞中， LTF可通过Akt/ P27/ cyclinE/Rb 途径及P19/ cyclinD1 发挥作用，从而诱导细胞周期阻滞。⑤诱导细胞凋亡。乳铁蛋白肽体外通过调节结肠癌细胞系和头颈部癌细胞系中凋亡相关基因的表达，诱导肿瘤细胞凋亡。综上可见，LTF具有广泛的抗肿瘤作用。

LTF 在鼻咽癌中作用及机制尚未明确。研究表明LTF的表达水平与鼻咽癌的侵袭和转移呈负相关。此外，LTF基因在鼻咽癌中可抑制EB感染，诱导细胞周期阻滞，抑制细胞增殖[4]。LTF在鼻咽癌中功能的研究，为鼻咽癌的发生机制及防治研究提示新方向。

参考文献：

[1] Yi HM， Li H， Peng D，et al. Genetic and epigenetic alterations of LTF at 3p21. 3 in nasopharyngeal carcinoma[J]. Oncol Res. 2006；16（6）：261～272.

[2] Legrand D， Elass E， Carpentier M， et al. Lactoferrin： a modulator of immune and inflammatory responses[J].Cell Mol Life Sci. 2005， 62（22）：2549-2559.

[3] Kuhara T， Iigo M， Itoh T， et al. Orally administered lactoferrin exerts an antimetastatic effect and enhances production of IL-18 in the intestinal epithelium [J]. Nutr Cancer， 2000， 38（2）：192 -199.

[4] Deng M， Zhang W， Tang H， et al. Lactotransferrin acts as a tumor suppressor in nasopharyngeal carcinoma by repressing AKT through multiple mechanisms[J]. Oncogene. 2013， 32（36）：4273-4283.