二苯乙烯苷上调SIRT1 蛋白防治心肌缺血再灌注损伤*

甘受益，李彩蓉，2＊＊，曾令勇，黄红霞，镇海涛，2，冯光瑞

(1.咸宁市中心医院心血管内科，湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院临床医学院)

急性心肌缺血是指急性冠状动脉闭塞，血流中断所致的心肌局部缺血性坏死，药物溶栓、经皮冠状动脉成形术及冠脉搭桥术等方法可及时恢复血供，改善心肌缺血。但研究［1］也发现恢复心肌血供在短时间内可加重原有的缺血性心肌损伤，还可导致心律失常、心力衰竭等更严重的损伤，这种现象被称为心肌缺血再灌注损伤(MIRI)。寻找减轻MIRI 的药物对治疗急性心肌缺血、提高预后具有重要的意义。SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog 1)是一种具有NAD2依赖的蛋白去乙酰化酶活性的多功能转录调节因子，在体内参与调控哺乳动物细胞寿命的不同信号通路、糖代谢及胰岛素分泌等。最近研究［2］发现敲除SIRT1 可加重小鼠心肌缺血再灌注损伤，提示SIRT1 在心肌损伤中起重要作用。中药何首乌属是多年生落叶藤本蓼科药用植物，具有多种保健和医药功能，二苯乙烯苷(TSG)是其最主要的活性成分之一，具有增强免疫力、抗衰老、抗氧化等多种生物学效应［3，4］，并且是SIRT1 最重要的激活剂之一，提示TSG 可能通过调节SIRT1 从而对MIRI 有防治作用。本研究采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法建立MIRI 模型，再灌注前预先给予TSG，观察其是否通过调节SIRT1 从而对抗MIRI。

1 材料与方法

1.1 试验药物

TSG(北京中国药品生物制品鉴定所，纯度98%，批号Z080912-3)，SOD、GSH-Px 和MDA 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);SIRT1、βactin 抗体(Santa Crtz，USA)。

1.2 动物

清洁级近交系雄性SD 大鼠(由湖北省医学科学院实验动物中心提供)，体质量(220 ±14)g，每笼5 只，饲养于标准环境，12h 光照周期。

1.3 仪器

DH2140B 型动物人工呼吸机(浙江医科大学医疗仪器厂);RM6240 生物信号采集处理系统(成都仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠心肌缺血再灌注模型的制备与处理

大鼠腹腔注射10%乌拉坦(4ml/kg)麻醉，气管切开并使用呼吸机通气。分离右侧颈总动脉，连接至RM6240 生物信号处理系统，记录左心室内压(LVSP)、左心室内压最大变化速率(±dp/dtmax)以及左心室舒张末期压力(LVEDP)，并同时记录肢体导联心电图。暴露心脏，用穿有聚氯乙烯管的手术线结扎冠状动脉左前降支，结扎30 min 后恢复血流灌注120 min 后结束实验。结扎后心电图出现ST 段抬高、QRS 波增宽或振幅加大表示模型成功。给药方式为结扎30min 后恢复血流前舌下静脉注射。实验分为假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+TSG(10mg/kg)组及缺血再灌注+TSG(20mg/kg)组。

1.4.2 心肌组织组织病理学检测

福尔马林固定心脏，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE 染色，在显微镜下观察心肌的形态学变化。

1.4.3 心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的活性、丙二醛(MDA)含量测定

操作按试剂盒(南京建成)说明书进行。

1.4.4 心肌组织SIRT1 表达检测

提取心肌总蛋白，以Western Blot 检测SIRT1表达，显影条带用图像分析系统分析。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 TSG 对缺血再灌注大鼠心功能的影响

缺血再灌注120 min 后大鼠LVSP 及±dp/dtmax 逐渐下降，而LVEDP 则进行性增加，表明大鼠心功能明显受损。TSG 治疗组与缺血再灌注组相比，大鼠LVSP 及±dp/dtmax 均有相应增加，而LVEDP 明显降低，表明TSG 对缺血再灌注所致的心功能损害具有一定防治作用，见表1。

表1 TSG 对大鼠心功能的影响(，n=10)

表1 TSG 对大鼠心功能的影响(，n=10)

与假手术组比较，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;与缺血再灌注组比较，#P ＜0.05、##P ＜0.01

2.2 TSG 对缺血再灌注大鼠心肌形态学的影响

HE 染色光镜下显示假手术组心肌细胞排列规整，染色均匀，胞核清晰可见，无炎性反应，缺血再灌注120 min 后心肌细胞排列混乱，染色深浅不一，心肌纤维萎缩，局部有灶性溶解坏死，间质可见炎性细胞浸润;TSG 治疗组心肌细胞排列较整齐，胞核较清晰，胞浆有部分空泡样变性，间质无炎性细胞，以大剂量TSG 治疗组效果更明显。

2.3 TSG 对缺血再灌注大鼠心肌SOD 和GSH 的活性、MDA 含量的影响

与假手术组相比，缺血再灌注大鼠心脏组织均浆中SOD 和GSH 活性明显降低(P ＜0.01)，MDA 含量显著上升(P ＜0.01)。TSG 治疗组能够增加心脏组织SOD 和GSH 活性，并且减少MDA的生成。提示TSG 可通过增加心肌抗氧化酶的活性及抑制心脏过度的脂质过氧化反应而起到心脏保护作用，见表2。

表2 TSG 对心肌组织SOD 和GSH-Px 的活性、MDA 含量的影响(，n=10)

表2 TSG 对心肌组织SOD 和GSH-Px 的活性、MDA 含量的影响(，n=10)

与假手术组比较，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;与缺血再灌注组比较，#P ＜0.05

2.4 TSG 对缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表达的影响

Western blot 结果显示缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表达下降，与假手术相比有统计学差异(P＜0.05)，TSG 治疗后心肌组织SIRT1 蛋白表达量上升，提示TSG 可能通过上调心脏SIRT1 蛋白水平而对心肌再灌注损伤有防治作用，见图1。

图1 TSG 对缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表达的影响

3 讨论

心肌血液供应以及新陈代谢是保证心脏正常功能的重要条件，心肌缺氧缺血会引起细胞结构性损伤，及时恢复缺血心肌的血液供应是治疗急性心肌缺血的重要原则。但大多数情况下心肌缺血再灌注后都会有一定的损伤，出现明显的功能障碍。我们采用手术线结扎冠状动脉左前降支后再松开的方式复制临床上常见的心肌缺血再灌注损伤的模型，结果发现缺血再灌注120 min 后大鼠心功能明显受损;心肌细胞排列混乱，染色深浅不一，心肌纤维萎缩，局部有灶性溶解坏死，间质可见炎性细胞浸润。TSG 治疗组结果显示TSG 能增加LVSP 及±dp/dtmax 及减少LVEDP，并且心肌组织结构发生明显改善，提示TSG 能防治缺血再灌注引起的心功能损害及心肌组织损伤。

目前研究认为缺血再灌注损伤的主要机理是细胞内的钙超载及氧自由基的产生增多所致。心肌缺血再灌注时，线粒体功能障碍，氧化酶活性降低，同时SOD、GSH 等还原酶的活性降低，清除活性氧的能力减弱，产生大量氧自由基。增加的氧自由基与细胞膜上的多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使得其过氧化产物MDA 含量增多，MDA 能破坏细胞膜导致细胞损伤。我们的结果显示TSG 可增加心脏组织SOD 和GSH-Px 活性，并且减少MDA 的生成，提示TSG 可通过增加心肌抗氧化酶的活性及抑制心脏脂质过氧化反应而起到心脏保护作用。

SIRT1 在哺乳动物组织中广泛表达，在机体的能量调控中起重要作用［5］。我们的前期研究发现TSG 能够通过上调肾脏SIRT1 蛋白的表达增强肾脏抗氧化能力而对糖尿病肾病有防治作用［6］，最近有研究发现敲除SIRT1 可加重小鼠心肌缺血再灌注损伤［2］。我们的实验显示缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表达明显下降，TSG 治疗组心肌组织SIRT1 表达明显上升，由于SIRT1 在能量调控中起重要作用，提示TSG 可能通过上调心脏SIRT1蛋白水平增强心肌的抗氧化能力而对心肌再灌注损伤有防治作用。

［1］Wu ZK，Iivainen T，Pehkonen E，et al.Ischemic preconditioning suppresses ventricular tachyarrhythmias after myocardial revascularization［J］.Circulation，2002，106(24):3091

［2］Hsu CP，Zhai P，Yamamoto T，et al.Silent information regulator 1 protects the heart from ischemia/reperfusion［J］.Circulation，2010，122(21):2170

［3］Zhang YZ，Shen JF，Xu JY，et al.Inhibitory effects of 2，3，5，4＇-tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside on experimental inflammation and cyclooxygenase 2 activity［J］.J Asian Nat Prod Res，2007，9(3-5):355

［4］李彩蓉，蔡飞，黎荣，等.二苯乙烯苷对糖尿病大鼠肾小球系膜细胞增殖及分泌炎症因子的影响［J］.中药药理与临床，2010，26(2):13

［5］Lavu S，Boss O，Elliott PJ，et al.Sirtuins-novel therapeutic targets to treat age-associated diseases［J］.Nat Rev Drug Discov，2009，8(6):516

［6］Li C，Cai F，Yang Y，et al.Tetrahydroxystilbene glucoside ameliorates diabetic nephropathy in rats:involvement of SIRT1 and TGF-β1 pathway［J］.Eur J Pharmacol，2010，649(1-3):382