大豆GAMYB基因序列分析及拟南芥同源突变体鉴定

李文滨，刘丽雪，谷月娇，闫海波，吕庆雪，赵琳，王朋朋，张可欣，丁福全

（东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室，农业部大豆生物学与遗传育种重点实验室），哈尔滨 150030）

大豆GAMYB基因序列分析及拟南芥同源突变体鉴定

李文滨，刘丽雪，谷月娇，闫海波，吕庆雪，赵琳，王朋朋，张可欣，丁福全

（东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室，农业部大豆生物学与遗传育种重点实验室），哈尔滨 150030）

GAMYB基因是赤霉素(GA)信号转导途径中的一个重要促进因子，该基因与植物由营养生长向生殖生长的开花过渡以及生殖发育有重要关系。通过构建系统进化树分析，发现该基因与拟南芥MYB33和MYB65亲缘关系较近，根据TAIR网站上公布的GAMYB-Like基因信息，从美国拟南芥生物资源中心购买该基因的T-DNA插入拟南芥突变体材料，运用双引物法对此突变体进行T-DNA插入位点的鉴定，分别获得3株和6株稳定遗传的纯合突变体，可为深入研究GmGAMYB基因的功能及进行互补拟南芥突变体myb33或myb65试验奠定基础。

GmGAMYB；序列分析；T-DNA插入突变体；拟南芥

大豆开花时间、花的数量及花的育性，严格控制大豆的生育期及产量，因而大豆生育期性状的改良和花的育性一直是研究的热点。赤霉素（GA）作为重要的植物激素[1]，在大豆整个生长发育时期具有重要作用。而GAMYB基因是赤霉素（GA）信号转导途径中的一个重要促进因子，该基因与植物由营养生长向生殖生长的开花过渡以及生殖发育有重要关系[2-5]，因此研究大豆该基因的生物学功能，对了解大豆开花及花的发育具有重要理论意义和应用价值。

拟南芥（Arahidopsits thaliana）具有植株小、生育期短、繁殖系数高等生物学特性。对其遗传学研究始于1907年。目前己分离得到许多拟南芥基因，利用突变体技术结合生理生化分析，是功能基因组学研究的手段之一，T-DNA插入突变技术的反向遗传学研究策略，是研究GmGAMYB基因功能系统而直观的途径和重要手段[6]。

目前，已在大麦、水稻、燕麦、拟南芥等植物中分离得到其相应的GAMYB基因[7-9]。GAMYB基因同源率较高，且具有高度保守结构。拟南芥中分离出的GAMYB-Like基因，共5个。AtMYB33和AtMYB65都能代替大麦中的GAMYB基因结合到淀粉酶的启动子上。本实验室通过基因序列比对及进化分析发现GmGAMYB与AtMYB33和AtMYB65功能相似[10]。用于鉴定突变体的方法即为“双引物法”，其基本原理，即采用特异引物扩增目的基因片段和T-DNA插入片段，通过比对扩增结果进行鉴定[11]。获得纯合突变体，可为深入研究GmGAMYB基因的功能及进行互补拟南芥突变体myb33或myb65试验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

拟南芥野生型（Col-O型）和T-DNA插入突变系（Salk_009640和Salk_058312）T1代种子由美国俄亥俄州立大学ABRC（Arabidopsis Biological Resource Center）提供。GmGAMYB1由东农42大豆品种中克隆获得。

1.2 培养条件

种子经表面消毒8 min，用无菌水清洗3～5次后点播于MS培养基上，置于4℃春化3 d后放入组培室中培养。当拟南芥种子发芽长出3～4片叶子时，将其转到灭菌的人工土（3份蛭石，1份珍珠岩和1份黑土混合）。培养室温度为（22±2）℃，光/暗周期为16 h/8 h，相对湿度80%。

1.3 单株总DNA的提取

采用SDS小量法抽提植物总DNA，取1～2 cm2的新鲜叶片液氮研磨，加入200 μL裂解缓冲液，40 μL 10%SDS，涡旋5 s后，50℃温浴30 min其间颠倒两次，再加入100 μL 5 mol·L-1KAc涡旋6 s，置于冰上放置30 min；加入500 μL酚/氯仿（1∶1），涡旋20 s，4℃，12 000 r·min-1离心5 min；取400 μL上清液，加入等体积的冷异丙醇，颠倒15次，4℃，12 000 r·min-1离心1 min；弃上清液，用70%乙醇洗涤后，4℃，12 000 r·min-1离心1 min；弃上清液，室温干燥后加入50 μL无菌水溶解，5 μL RNase消化，-20℃保存[12]。

1.4 GmGAMYB1与AtMYB33和AtMYB65等基因的序列分析

使用Blast（www.phytozome.com）分析GmGAMYB1基因所编码的氨基酸序列的相似性，并用DNA⁃MAN进行多重比对，构建相关GAMYB基因系统进化树。

1.5 “双引物法”PCR鉴定

1.5.1 纯合突变体的初步鉴定

首先以基因组DNA作为模板，用一对特异引物（LP和RP）扩增目的基因片段，初步鉴定出纯合突变体，进行PCR扩增。PCR所用引物的设计参照SIAGnAL的相关资料（http://signal.salk.edn/is⁃ectprimers.html）myb33（salk_058312）的PCR引物为LP1和RP1，序列分别为：LP1 5′ATCCAGAA CTGT CAGACGCTG 3′，RP1 5′AATTGCGTATTTG GTTG GATG 3′。myb65（salk_009640）的2条PCR引物为LP2和RP2，序列分别为：LP2 5′TGGTGGG TTCC TTTTTATCAAG 3′，RP2 5′AAGCAAGACAG ACTC⁃CAGCAG 3′反应体系：DNA 1 μL，10×PCR Buf⁃fer 2.5 μL，dNTP Mix（10 mmol·L-1）0.5 μL，LP1 0.5 μL，RP1 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 19.5 μL，总体积25 μL，循环参数94℃5 min；38个循环：94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min；72℃5 min；取8 μL进行0.8%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

1.5.2 T-DNA插入突变的验证

以初步鉴定为纯合突变株的总DNA为模板，以LB RP1和LB RP2分别作为引物，引物序列为：LB5′ATTTTGCCGATTTCGGAAC 3′，RP15′AATTGCGTATTTGGTTGGATG 3′，RP2 5′AAGCA AGACAGACTCCAGCAG 3′进行PCR扩增。反应体系、循环参数及扩增结果的检测和记录方法同上。

1.6 表型观察

野生型和突变体种子按照1.2所述培养方法在含琼脂的MS培养基上培养。种子萌发后，待其长出4片叶之后，将其移入土和蛭石中培养，待其长大后，观察其表型：株高，莲座叶数，叶片大小，开花早晚等。

2 结果与分析

2.1 GmGAMYB的序列分析

通过文献确定AtMYB33和AtMYB65功能较相似并且冗余，均为GAMYB-like家族基因，将GmGAMYB1基因与下列物种的GAMYB基因进行序列比对，可知，除不同品种的大豆与基因序列极为相似外，GmGAMYB1与AtMYB33和AtMYB65是不同物种中序列最为接近的，利用突变体研究GmGAMYB1是可信的（见图1）。

图1 GAMYB基因系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of GAMYB gene

2.2 “双引物法”鉴定myb33（salk_058312）

纯合突变体的第一步PCR鉴定结果如图2a所示，纯合突变体的第二步PCR鉴定结果如图2b所示。

myb33（salk_058312）突变体用LP1 RP1引物进行PCR反应可得1 151 bp大小的目的片段，由于T-DNA的插入，所以用LB RP1引物进行PCR反应可得592～892 bp左右的片段。

图2 myb33第一步（a）和第二步（b）PCR鉴定Fig.2 PCR identification of the first step（a）and the second step（b）of myb33

如图3所示，9个样中，经过第一步反应知道4和5可检测出MYB33的目的片段大小，第二步检测T-DNA插入反应可知2、4、6、7检测出T-DNA插入。所以纯合突变体植株即为2、6、7。

2.3 “双引物法”鉴定myb65（salk_009640）

纯合突变体的初步鉴定结果如图3a所示，突变体纯合体的鉴定结果如图3b所示。myb65（salk_ 009640）突变体用LP2 RP2引物进行PCR反应可得1 290 bp大小的目的片段，由于T-DNA的插入，所以用LB RP2引物进行PCR反应可得602～902 bp左右的片段。

开花及结荚期拟南芥表型见图4。

图3 Myb65第一步（a）和第二步（b）PCR鉴定Fig.3 PCR identification of the first step（a）and the second step（b）of myb65

图4 开花及结荚期拟南芥表型观察Fig.4 Phenotype observation of flowering and fruiting period

由图4可知，8个样本中，经过第一步反应可知，5可检测出MYB33的目的片段大小，第二步检测T-DNA插入的反应可知1～7检测出T-DNA的插入。所以纯合突变体植株即为1、2、3、4、6、7。

2.4 不同时期表型差异

按照1.2所述的培养条件，将野生型拟南芥和myb33突变体相比较，如图5～6所示，突变植株发育相对缓慢，植株叶片较小，根系相对不发达，开花相对野生型较晚。

图5 生长15 d拟南芥Fig.5 Arabidopsis thaliana of 15 d

图6 生长30 d拟南芥Fig.6 Arabidopsis thaliana of 30 d

3 讨论

野生型植株（Wild type,WT）目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，以基因组DNA作为模板，用一对特异引物（LP和RP）扩增目的基因片段，PCR产物大小与目的基因大小一致，分子质量约900 bp，即从LP到RP；纯合突变体植株（Ho⁃mozygous lines,HM）目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也能得到1种以LB与RP为引物进行扩增的产物，分子质量约410+N bp从LP或RP到T-DNA插入位点的片段，杂合突变体植株（Hetero⁃zygous lines，HZ）只在目的基因的一条染色体上发生T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+ N bp和900 bp两种产物。

对T-DNA插入突变体的鉴定，查阅相关文献，引物的设计一般是直接利用http://signal.sulk.edu/tdnaprimers.2htm1网页提供的软件。本试验也是根据TAIR官方网站公布的基因T-DNA插入位置，找到其突变体的类型，搜索到检测所需的3条引物，对突变体进行检测，检测结果发现条带不专一，与固定值有些出入，但是在其给定的理论范围内，选取大小在范围内的作为T-DNA插入的突变体，用于后续试验。

在拟南芥中有120多个拟南芥基因R2R3 MYB基因，MYB家族认为是植物最冗余的转录因子家族之一[13-16]。且MYB参与多种过程，包括控制细胞性状、抗病性、调节次级代谢和激素信号转导[17-18]。在拟南芥中最早分离出3个GAMYB-like基因，分别是AtMYB33、AtMYB65、AtMYB101,且通过前人报道可知，MYB33和MYB65在花发育阶段起重要作用[19-20]。所以，GmGAMYB1可用于研究发育阶段的功能。

GmGAMYB1基因的具体功能尚不明确，但是通过文献阅读和其他物种同源基因的功能比对可知，其除具有花药发育等育性相关功能外，还可能含有干旱、盐胁迫、耐高温等生物胁迫的功能原件，是否有类似功能，有待进一步研究。

4 结论

a.通过系统进化树比对，双子叶植物大豆GAMYB基因与单子叶植物拟南芥AtMYB33和At⁃MYB65的亲缘关系较近。其次是研究较多的葡萄属，同时与柑橘属、木薯属、蓖麻和毛杨属、李属的GAMYB在进化上亲缘关系较近。

b.试验运用双引物法对此突变体进行T-DNA插入位点的鉴定，分别获得3株和6株稳定遗传的纯合突变体，为深入研究GmGAMYB1基因功能及进行互补拟南芥突变体myb33或myb65试验奠定基础。

c.在相同培养条件下，发现AtMYB33和At-MYB65基因纯合突变体与野生型Col-0的形态有差异。突变体株型变小，莲座叶片小，开花较晚，果荚变短，成熟期晚于Col-0型。这种现象表明，AtMYB33和AtMYB65基因参与调控植物的生长发育。即与其同源率较高，进化相近的GmGAMYB基因也可能具有类似功能。所以本试验获得的AtMYB基因纯合突变体，可为进一步研究大豆GAMYB基因的功能是否与拟南芥中MYB基因功能相似和互补奠定基础。

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BioinformaticanalysisofsoybeanGAMYBgenesequenceand identification of its homozygous mutant inArabidopsis thaliana

LI Wenbin,LIU Lixue,GU Yuejiao,YAN Haibo,LV Qingxue,ZHAO Lin,WANG Pengpeng,ZHANG Kexin,DING Fuquan
（Laboratory of Soybean Biology in Chinese Ministry of Education＜Key Laboratory of Soybean Biology and Breeding/Genetics of Chinese Agriculture Ministry＞,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

GAMYBgene is an importantly promotive factor in the signal transduction pathways of gibberellin(GA).The gene played an important role in plant flowering transition from vegetative growth to reproductive growth and reproductive development.In order to determin wether a similar biological function existed betweenGmGAMYBgene ofGlycine maxand the one ofArabidopsisa phylogenetic tree was constructed according to GAMYB sequence data.GmGAMYBgene was closely related toArabidopsis MYB33 andMYB65.According to the information published on TAIR website,the homozygous genetic T-DNA insertion mutant of GAMYB-Like gene were obtained from TAIR.Using double primer method identified this T-DNA insertion mutant,respectively obtained three and six stably inherited homozygous mutant.These homozygous mutant lay a good foundation for further investigating the function ofGmGAMYBgene in complementingArabidopsis myb33 ormyb65 mutants.

GmGAMYB;sequence analysis;T-DNA insertion mutant;Arabidopsis thaliana

S767.5；X172

A

1005-9369（2014）04-0001-06

2012-12-12

国家自然科学基金（31101169,30671318，31271748）；黑龙江省教育厅省高校青年学术骨干项目（1253G010）；十二五农村领域国家科技计划课题（2013AA102602）

李文滨（1958-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为大豆遗传育种。E-mail：wenbinli@yahoo.com。

时间2014-4-21 13:24:10[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1324.022.html

李文滨,刘丽雪,谷月娇,等.大豆GAMYB基因序列分析及拟南芥同源突变体鉴定[J].东北农业大学学报,2014,45(4)∶1-6.

Li Wenbin,Liu Lixue,Gu Yuejiao,et al.Bioinformatic analysis of soybeanGAMYBgene sequence and identification of its homozygous mutant inArabidopsis thaliana[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶1-6.(in Chinese with English abstract)