代谢组学法评价紫苏子抗小鼠急性肝损伤的作用

耿 芹，郑床木，管 政,3,*，张小红，朱 超，杨曙明，陈爱亮,*

代谢组学法评价紫苏子抗小鼠急性肝损伤的作用

耿 芹1，郑床木2，管 政2,3,*，张小红2，朱 超2，杨曙明2，陈爱亮2,*

（1.华烁科技股份有限公司，湖北 武汉 430074；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；3.浙江中医药大学药物研究所，浙江 杭州 310053）

用代谢组学法对紫苏子抗小鼠急性肝损伤作用进行评价。研究构建四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝损伤模型，采用流动注射-三重四极杆-飞行时间质谱联用系统对模型组、紫苏子给药组、阳性药联苯双酯给药组及正常对照组动物的肝组织及全血代谢轮廓谱进行比较。采用主成分分析法对各组数据进行分析并初步筛选潜在生物标志物。代谢组学分析、血生化指标检测及病理研究表明，20 g/kg生药当量的紫苏子醇提物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型具有与联苯双酯临床等效剂量相似的保肝作用。结果表明，柠檬酸、磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺等9 个代谢物为CCl4致小鼠急性肝损伤及紫苏子保肝作用的潜在生物标志物；作用途径与脂质过氧化、能量代谢等有关。

紫苏子；流动注射；质谱；急性肝损伤；代谢组学；主成分分析

紫苏子为唇形科植物紫苏（Perilla frutescens（L.）Britt.）的干燥成熟果实。常用于痰壅气逆，咳嗽气喘，肠燥便秘的治疗[1]。作为一种在东南亚、北美等地区广泛种植使用的药食两用作物[2]，紫苏具有巨大的经济价值与开发潜力。现代药理研究表明，紫苏子除具有以上功效外，其酚性成分还具有强抗氧化、抗脂质过氧化、抗炎作用及基于此对肝损伤的保护作用[3-5]。

代谢组学（metabonomics/metabolomics）是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门通过对某一生物或细胞中特定生理时期内所有低分子量代谢物的集合进行定性、定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化相对关系的学科，是系统生物学的重要组成部分[6-7]。近年来，在国内先驱者将代谢组学引入中医药领域之后，中医药代谢组学研究得到了蓬勃的发展，为中药整体药效学评价和中医药作用机制及其理论研究提供了强有力的现代化研究手段[8-10]。同时，随着食品组学概念[11-12]的提出及其在西方各国的悄然兴起，采用代谢组学法对具有药食两用价值的经济作物展开研究已成为我国农产品进一步占据功能食品国际市场的需要。

流动注射-质谱联用技术作为一种具有高通量分析能力的方法，虽然会带来一定的基质效应等问题，但随着化学计量学及质谱分析技术的发展，近年来的方法学比较研究表明流动注射-电喷雾质谱指纹谱在分析中的应用具有和液质联用[13-15]、气质联用[16-20]以及核磁共振指纹图谱技术[21-22]相当的信息量和分析价值。这进一步使得该种具有快速分析能力的技术在需要大样本、大数据量采集分析的代谢组学、临床检测及相关药效、毒理及机制研究中有了发挥的空间[23-24]。

据此，本实验采用了基于流动注射-三重四极杆-飞行时间质谱联用技术结合主成分分析（principal component analysis，PCA）的代谢组学法与传统药理病理学指标比对，对紫苏子抗四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝损伤作用进行分析，寻找与紫苏子保肝作用密切相关的潜在生物标志物，以探讨其药效及可能的作用机制，为进一步利用代谢组学进行相关药效学研究及紫苏子作为功能食品的保健价值提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级昆明小鼠，雄性，体质量（35±3）g，购自北京大学医学部实验动物科学部，许可证号：SCXK（京）2011-0012。

紫苏子（标本号：20111017-LB），购自河北安国冷背药材有限公司，经陈爱亮副研究 员鉴定。

谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）测试盒、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）测试盒南京建成生物工程研究所；联苯双酯滴丸 北京协和药厂；甲醇、甲酸（色谱纯） 美国Fisher 公司；Milli-Q超纯水 美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色谱仪美国Agilent公司；AB MDS SCIEX QSTAR®Elite质谱仪美国AB SCIEX公司；BX-61万能显微镜 日本Olympus公司；Infinite F200多功能酶标仪 瑞士Tecan公司；AL104电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；全能台式高速冷冻离心机 美国Thermo Scientific公司；LYOVAC GT2型冷冻干燥机 德国SRK公司。

1.3 方法

1.3.1 紫苏子醇提物制备方法

取紫苏子药材1 kg，加3 倍量80%甲醇冷浸提取3 次，每次24 h，合并提取液，减压回收，得浸膏，冷冻干燥，得粉末。

1.3.2 模型建立

小鼠常规饲养3 d适应环境后随机分为正常对照组、CCl4急性肝损伤模型组、病理模型紫苏子醇提物给药组及病理模型联苯双酯给药组，每组8 只。除正常对照组外，其他每组小鼠按20 mL/kg体质量腹腔注射0.1%（V/V）的CCl4花生油造模[25-26]；造模同时灌胃给药，紫苏子醇提物给药剂量按生药材计为20 g/（kg·d）；联苯双酯组每天给药3.5 mg/（kg·d）；正常对照组及模型组则灌胃等容量的生理盐水。造模后，连续给药治疗3 d，于第3天给药后3 h采集样本。

1.3.3 急性肝损伤药效学实验

各组动物于末次给药3 h摘眼球取血。部分血液样本4 ℃静置过夜，3 000 r/min离心10 min取血清，供ALT、AST检测用（样本处理及检测方法按说明书操作）。取部分肝脏置于37 g/100 mL的中性甲醛溶液（福尔马林）中，石蜡包埋、切片，常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，光学显微镜观察。

1.3.4 质谱样品采集与预处理

肝组织样品0.5 g，按1∶2（m/V）加入生理盐水做组织匀浆。组织匀浆液及血液样本（0.8 mL）分别按1∶1（V/V）加入0.1 mol/L的HCl溶液中使药物蛋白质解离，12 000 r/min离心5 min，继续加入3 倍量甲醇沉淀蛋白质，12 000 r/min离心10 min。吸取上清，37 ℃氮吹至干。加入1 mL 5%甲醇（含0.1%（V/V）甲酸）涡旋复溶，过Waters公司Oasis系列HLB小柱，自然流速上样、洗脱，洗脱液为80%甲醇（含0.1%甲酸，过0.22 μm滤膜）。

1.3.5 色谱条件

两通连接，流动相甲醇，流速0.3 mL/min，进样量10 μL，数据采集时间1 min，流动注射、直接进样供质谱数据采集及PCA。

1.3.6 质谱条件

电喷雾离子化源（ESI），正负离子同时检测。扫描方式为全扫描，飞行时间质谱离子扫描范围m/z 100～1 000。喷雾电压4.2 kV，去簇电压60 V，去簇电压2为10 V，调焦电压265 V。碰撞气及雾化气均为氮气，碰撞能35 V。其余参数：雾化气60 psi；辅助气50 psi；气帘气20 psi；碰撞气5 psi；温度500 ℃。两通连接、流动注射直接进样。

1.4 数据处理

药理实验数据以x±s值表示，做独立样本t检验进行组间差异比较。质谱数据通过Analyst QS 2.0软件采集、m/z识别，离子峰相对信号强度进行内标校正，将稳定出现的、质谱丰度0.5%以上的离子数据导入至Excel软件，手动对齐各组数据。将各组数据分别与模型组数据做独立样本t检验进行组间差异比较，剔除没有统计学意义的变量（P＞0.05）后，得到有意义的变量值76 个（血液及肝组织样本共有），导入统计学软件IBM SPSS Statistics 19的因子分析项中做PCA。

2 结果与分析

2.1 急性肝损伤药效学实验

图1 小鼠肝脏组织病理形态改变（HE染色）Fig.1 Histopathological changes in livers of mice (HE staining)

如图1所示，组织病理学检查结果表明，正常对照组肝小叶结构清晰，无肝细胞坏死；CCl4急性肝损伤模型组的肝脏正常结构被破坏，肝小叶排列紊乱，可见肝细胞变性及大面积灶状坏死；紫苏子醇提物给药组及联苯双酯给药组的肝细胞索排列较整齐，胞浆染色与正常对照组接近，脂肪空泡减少，嗜伊红染颗粒及肝细胞灶状坏死面积减少。

如表1所示，生化指标测定结果表明，紫苏子醇提物对CCl4所致急性肝损伤小鼠血清转氨酶升高有明显降低作用。在本实验设定给药剂量下，其对血清转氨酶的降低作用与联苯双酯临床等效剂量相似，与模型组相比有极显著差异。

表1 紫苏子醇提物对CCl 急性肝损伤小鼠肝生化指标的影响 x±s, , n＝8）Table 1 Effects of perilla seed extract on hepatic biochemical parameters in mice ( x±s, , n＝8)

2.2 小鼠代谢指纹质谱

小鼠代谢指纹质谱全扫描情况见图2。得到有意义的变量值76 个（为血液及肝组织样本共有，图2只给出血液样本指纹质谱图）做PCA。

图2 小鼠血样代谢指纹质谱图（负离子模式）Fig.2 MS metabolic fingerprinting of mouse blood samples (negative ion mode)

2.3 全血及肝脏样本质谱数据代谢组学分析

图3 小鼠血液及肝脏样品质谱数据得分图（负离子模式）Fig.3 PCA score plot based on the MS metabolic profiling of mouse blood and liver samples (negative ion mode)

如图3所示，将质谱数据做PCA，正常对照组、模型组、紫苏子醇提物给药组、联苯双酯给药组血液及肝脏组织的样本点均得到了较好分离，结果与病理切片及生化指标可相互佐证，说明小鼠灌胃给药后机体生理及物质代谢情况已经发生明显改变，可对各组样品进行区分。

2.4 潜在生物标志物鉴别

图4 小鼠血液及肝脏样品质 谱数据共有变量PCA载荷图Fig.4 PCA loading plot for IT-MS fingerprints of blood and liver samples of mice

PCA载荷图能体现变量对于主成分贡献的大小，在某一主成分方向上距原点越远的变量对此主成分的贡献越大。离质心越远的数据点，即“离群”数据点则常可作为相应分析的标志性变量。选取PCA载荷图（图4）中既“离群”又离原点较远的数据点作为可能的生物标志物进行分析。潜在生物标志物鉴别，则依据各离子的一级及二级质谱的精确质荷比值，到METLIN、KEGG、HMDB、MASSBANK、CHEMSPIDER、METFRAG数据库中进行检索，推断可能的结构及潜在生物标志物。鉴定结果见表2，组间变化情况见图5。

表2 潜在生物标志物鉴定Table 2 Identification of potential biomarkers

图5 与小鼠急性肝损伤相关的潜在生物标志物及其相对含量变化趋势Fig.5 Variations in potential biomarkers associated with acute liver injury syndromes

3 讨 论

CCl4对动物体的毒性作用，主要由具有强氧化性的三氯甲基自由基引起。经过肝脏代谢后，它所生成的自由基会与微粒体脂肪及其他的细胞巨分子结合，造成细胞膜结构、线粒体、内质网、细胞能量传送系统、蛋白合成途径及核脂质、核蛋白、DNA等的破坏[27-28]。在本实验中，动物经CCl4处理后，肝组织及血液样本中柠檬酸含量上升，给予紫苏子醇提物后含量回落，接近正常对照组，表明紫苏子醇提物可通过改善三羧酸循环的代谢情况而对CCl4引起的肝脏线粒体功能紊乱有改善作用。该成分的变化趋 势与黄欣等[29]的报道一致，而与彭思远等[30]的研究情况相反，认为可能是由于CCl4与全氟辛酸造成肝损伤的作用机制不同引起。同时，在本研究中磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺及肉毒碱在给予CCl4后上调，给予紫苏子醇提物后下调的系列变化，总体变化趋势与有关报道一致，体现了紫苏子醇提物对脂质代谢及细胞膜系统的良好作用[31]。其中，磷脂酸（13∶0/0∶0）及溶血磷脂酰乙醇胺（16∶0）未见报道，可能为新的潜在的急性肝损伤生物标志物。此外，由于CCl4引起的细胞核等的破坏，肌苷及甲基化核苷也呈现了上升趋势，此趋势与彭思远等[30]的研究结果相同。同时，给药联苯双酯及紫苏子醇提物则可回调肌苷及甲基化核苷的相对含量。在本研究中，牛磺胆酸类物质的变化情况则与徐英等[32]报道的趋势相同，肝损伤情况下该类物质含量上升，给予治疗药物则下调，表明CCl4所致小鼠急性肝损伤及其相关药物的治疗效果亦可通过影响胆汁酸代谢网络起作用。

本研究发现主要含有迷迭香酸、迷迭香酸苷及黄酮类物质的紫苏子醇提物，对CCl4致小鼠急性肝损伤有较好的保护作用，其作用强度在生药当量20 g/kg时，作用效果与联苯双酯临床等效剂量相当。ALT、AST、病理切片及代谢组学分析结果均表明了紫苏子醇提物的药效，实验结果可相互佐证。

这种基于流动注射进样的飞行时间质谱数据分析的代谢组学研究方法[33]，相较传统药效学评价方法，在数据挖掘、病理机制及药物作用机制分析方面十分有优势。较之传统的高效液相色谱柱分离之后再做质谱检测分析的方法，则具有检测速度快（1 min每个样品）、受外在因素干扰小的优点。尽管单纯质谱分离能得到的化合物信息较色谱柱分离后再做质谱检测会有所减少是它的一个劣势，但这种旨在和动物药效研究及临床检测方法接轨的探索所得到的潜在生物标志物将可直接应用于后者的分析，方便对大批量数据同时进行检测与数据挖掘。这对于作为药效学研究需要足够样本量的实验以及临床诊断快速检测来说，很有帮助。同时，也相信随着多种检测技术的整合、组学技术及化学计量学研究的发展，这种基于质谱快速分析的方法将 会为药效学研究及临床快速诊断带来帮助，并成为建立客观、量化的中药整体药效作用评价体系的重要组成部分。

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Protective Effect of Perilla Seed on Acute Hepatic Injury in Mice as Evaluated by Metabolomic Analysis

GENG Qin1, ZHENG Chuang-mu2, GUAN Zheng2,3,*, ZHANG Xiao-hong2, ZHU Chao2, YANG Shu-ming2, CHEN Ai-liang2,*
(1. Haiso Technology Co. Ltd., Wuhan 430074, China; 2. Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Institute of Materia Medica, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

The objective of this study was to evaluate the protective effect of perilla (Perilla frutescens) seed on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride. Identification of potential biomarkers was performed by high-performance liquid chromatography (HPLC) and flow injection electrospray ionization with time-of-flight (TOF) mass spectrometry (FIMS) combined with principal component analysis (PCA). Blood and hepatic tissue metabolic profiles were acquired and correlated with the biochemical and histopathological results. In this work, metabolomic profiling, and biochemical and histopathological studies together confirmed th e liver protective effect of perilla seed. Perilla seed at a dose equivalent to 20 g/kg per day caused a similar effect to that of bifendate (3.5 mg/kg per day). Compared with normal control group, the expression of LysoPC, LysoPE, PA, carnitine, citric acid, inosine, methylated nucleoside, and taurohyocholate were increased significantly in model group, whereas the opposite results were observed for the animals which had given perilla seed extract. These findings indicated that the developed metabonomic method based on FIMS might be used as a potentially powerful tool for fast and comprehensive estimation of the liver protective effect of perilla seeds.

perilla seed; flow injection; mass spectrometry; acute hepatic injury; metabonomics; principal component analysis

TS255.1

A

1002-6630（2014）17-0260-06

10.7506/spkx1002-6630-201417050

2013-10-30

耿芹（1980—），女，本科，研究方向为分析化学。E-mail：yujia0715@sohu.com

*通信作者：管政（1980—），女，硕士，研究方向为中药学。E-mail：zhengguancn@163.com

陈爱亮（1975—），男，副研究员，博士，研究方向为食品科学。E-mail：ailiang.chen@gmail.com