猪精液常温保存稀释液的应用研究

丑武江，王世银，杨力伟，张兆旺，张莉君，张 伟＊

（1.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉831100；2.甘肃农业大学动物科技学院，甘肃兰州730070；3.新疆乌鲁木齐荣盛养殖场，新疆乌鲁木齐830000）

随着家畜人工授精技术优势的日益显现，猪精液的保存越来越受到人们的重视。国内对猪精液常温保存稀释液配方的研究主要集中在两个方面，一是对稀释液基础配方的筛选，在常规葡萄糖和柠檬酸钠液的基础上，参考国外进口稀释液的配方组成，通过调整渗透压、pH 或缓冲指数等筛选猪精液常温保存稀释液的基础配方［1－5］。耿果霞等［2］研究表明，pH 为6.4 和6.5 的弱酸环境有利于猪精子的常温保存；黄建国［3］研究表明，渗透压为226mmol／L～387mmol／L（冰点下降值为0.42～0.72）时精液保存效果较好。二是研究在基础液中添加安钠加、咖啡因、维生素E、半胱氨酸以及不同的抗生素、中草药等对猪精液常温保存效果的影响［5－11］。罗义梅［6］发现，猪精液稀释液中添加0.5%～1%的安钠咖可有效延长精子的受精能力；张能适等［7］研究认为在每100mL稀释液中加入5～10mg的苯甲酸钠咖啡因也取得了较好的保存效果，张兆旺等［11］用中草药的水剂保存猪精液，发现可有效缓解精子的衰老，延长精子存活时间。

众多研究对猪精液的常温保存提供了可靠的理论依据，但缺乏系统的液体参数控制方法，只对某一个稀释液参数进行筛选，存在很大的盲目性，且大大增加了后期筛选试验的工作量。

鉴于此，本研究首先确立了对稀释液重要参数－渗透压、pH 和缓冲指数的理论控制方法，在确定其准确性的基础上，借鉴前人研究成果及本实验室的前期研究数据，设计9 个稀释液配方，并以进口BTS液为参照，筛选出最佳稀释液配方，旨在开发具有自主知识产权的稀释液配方用于生产实践，降低猪人工授精的成本，同时也为其它家畜、家禽稀释液的筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验用精液采自乌鲁木齐荣盛养殖场2头杜洛克公猪，年龄分别为2.5岁和3岁。输精母猪为该场大×长二元母猪，共计120头，胎次在3～5胎之间。试验动物按常规进行饲养和管理。

1.2 主要试剂及仪器

配制稀释液的试剂均为国产分析纯，电子天平（Sartorius公司）、渗透压仪（Advanced公司）、酸度计（成都汉维斯科技有限公司）、精子质量评定系统（北京中西远大科技有限公司）、生物显微镜（Motic）、17 ℃恒温箱（50L，青岛海尔集团）、超纯水系统（ABBOTA 公司）。

1.3 稀释液配方设计

1.3.1 精液稀释液pH 控制 根据“酸抑制”原理，弱酸性对精子的活动有抑制作用，有利于精液的保存，所以精液液态保存稀释液的pH 应该偏酸性［12］。按照冲液pH 计算公式，对其进行控制。

式中：Pka为电离常数，Ca和Cs分别为弱酸及其弱酸盐的浓度，Ca／Cs又称缓冲比。将期望得到的pH 代入上式，可以得到所需pH 时需要加入的弱酸和弱酸盐的浓度。按文献［12］所示，结合本实验室的研究数据，猪精液常温保存稀释液的pH 控制在6.0～6.5之间。

1.3.2 精液稀释液渗透压控制 精液液态保存稀释液渗透压按公式（2）进行控制：

式中：m（g）为每配制100mL 稀释液需要加入试剂的质量，A（mmol／L）为渗透压，M 为相应试剂的分子量。n为该试剂溶于水后解离成的离子数，例如葡萄糖溶于水不解离，则n为1；KCl溶于水后解离成K＋和Cl－，则n为2。将期望得到的渗透压值A 代入上式，得到要加入相应试剂的质量m。

1.3.3 精液稀释液缓冲能力的控制 按照以上精液稀释液重要指标控制原理，参照前人研究成果及本实验室前期数据，设计9个稀释液配方（见表1）。

1～4号液主要是通过调整葡萄糖的量控制稀释液的渗透压，并通过计算理论值与实际测量值的误差确定上述渗透压控制的准确性，然后通过精液保存试验确定合适的渗透压水平。5～9号液则以此渗透压值为标准，通过调整稀释液成分改变其pH、缓冲能力及离子强度，并以进口BTS 液为参照，通过精液保存试验筛选最佳配方用于猪精液常温保存。

表1 猪精液常温保存稀释液成分Table 1 Swine semen extender ingredient and dose

1.4 精液采集、处理及保存

手握法采集公猪精液，四层纱布滤除胶状物，置于保温桶中迅速带回实验室。气味、色泽正常，活力在0.8以上的精液分别用上述9中稀释液按照1∶2 的比例稀释，分装到青霉素小瓶中，外面包上五层纱布后置于17 ℃恒温箱中保存。每隔6 h，将稀释精液轻轻震荡混匀，以防精子沉淀堆积死亡。

1.5 精液保存效果评定

每12h进行一次精液品质评定。精子活力为直线运动的精子占视野中总精子数的百分率，按照10级评分制进行评定；精子有效存活时间是指精子活力在0.5以上的保存时间；精子生存指数指相邻两次精子活率均数与间隔时间乘积的总和，其计算公式参照文献［11］所示。

1.6 母猪输精试验

通过与进口BTS稀释液的对比试验，将上述稀释液中最优的稀释液按照1∶2的稀释比例稀释猪精液，在17℃恒温箱中保存5d，精子活力在0.5以上的稀释精液用于人工授精试验，通过情期受胎率和产仔数最终衡量其精液保存效果。

1.7 数据处理

试验均重复3 次，采用SPSS13.0统计软件用方差分析进行差异显著性分析，结果用“平均值±标准差”的形式表示。

2 结果与分析

2.1 稀释液pH、渗透压和缓冲指数控制准确性

由表2知，用上述方法控制精液稀释液的pH、渗透压和缓冲指数切实可行，三者的准确性分别达到97.1%～99.42%、98.7%～99.68%和98.48%～99.16%，完全可以满足稀释液配方的设计。

2.2 不同渗透压对猪精液常温保存的影响

由表3可以看出，当渗透压为345mmol／L 时，精液的有效保存时间为116.8h，生存指数26.12，均极显著地高于渗透压为336mmol／L、352mmol／L和370mmol／L（P＜0.01）。因此，5～9号液设计时渗透压均控制为345mmol／L。

表2 9种稀释液配方pH、渗透压、缓冲指数理论值与实测值比较Table 2 The comparison of pH，osmotic pressure，buffer index of theoretical value and measured value

表3 不同渗透压对猪精液常温保存的影响Table 3 The effect of different osmotic pressure on swine semen preservation

2.3 最佳稀释液配方的筛选

以345mmol／L为标准控制渗透压，通过改变配方组分设计5－9号稀释液，以进口BTS液为参照，通过精液保存试验筛选最佳配方用于后续的常温保存及输精试验（见表4）。

由表4可知，9号液有效保存时间极显著高于5、6、7和8号液（P＜0.01），生存指数显著高于8号液（P＜0.05），极显著高于5、6 和7 号液（P＜0.01）。与进口BTS液相比，虽然BTS液的保存时间略长，但二者差异不显著（P＞0.05）。可见，本试验筛选的9号稀释液的精液保存效果已达到进口同类稀释液水平，可以用于猪人工授精试验，以最终评价该稀释液的优劣。

表4 不同稀释液对猪精液常温保存的影响Table 4 The effect of different extender on swine semen preservation

2.4 9号稀释液液常温保存猪精液对母猪情期受胎率和产仔数的影响

以进口BTS液为对照，用9号稀释液稀释猪精液，在17℃恒温箱中保存5d，精子活力在0.5以上的稀释精液用于人工授精试验。共输精母猪120头，具体结果见表5。

可见，和进口BTS 液相比，9 号稀释液常温保存5d的猪精液情期受胎率、平均窝产仔数虽然略低，但二者差异不显著（P＞0.05），可以作为其替代产品用于我国猪人工授精。

表5 9号稀释液常温保存精液配种成绩Table 5 The atificial insemination result of preservation semen extended by the 9th extender

3 讨论

3.1 猪精液常温保存稀释液主要溶液参数的控制

猪精液保存在17℃时，精子仍处于活动状态，只是强度有所下降。稀释液的pH、渗透压和缓冲指数对精子活力的维持具有重要影响，在稀释液配方设计时应予以重点考虑。这三个参数可以通过调整稀释液各个组分的相对量而调整，但需要设计大量配方，然后通过精液保存试验进行筛选，存在很大的盲目性，后期筛选试验工作量很大。本试验中，在配方设计前先通过计算对上述三个指标进行理论控制，很大程度上避免了这种盲目性，大大提高了配方筛选的效率。通过理论计算及实际测量，pH、渗透压和缓冲指数控制的准确度分别达到97.1%～99.42%、98.7%～99.68%和98.48%～99.16%，可以满足精液稀释液配方设计的要求。

3.2 不同pH 对猪精液常温保存效果的影响

酸性环境对精子活动有抑制作用，相反碱性环境对精子活动有刺激作用，精子可以在附睾内存活30～60d，与附睾内的pH 为弱酸性（6.2～6.8）有密切的关系［12］。何兰花等［8］对稀释液pH 为6.4、6.6、6.8和7.0时猪精液常温保存效果进行比较，结果表明pH 为6.4时保存效果最好［8］，这与耿果霞等［2］的研究结果一致。本试验中，保存效果和受胎率最高的9号液，pH 实测值为6.28，也证明偏酸性的pH 环境有利于精子活力的保存。但是由于猪精液常温保存过程中，精子代谢产生的CO2会使稀释液的pH 进一步降低，如果超过精子的耐受能力必然会影响精子的存活，所以稀释液自身的pH 不能过于偏酸性。

3.3 不同渗透压对猪精液常温保存效果的影响

精子之所以能够在附睾中存活较长的时间，除了与其中弱酸性的环境有关以外，另一个重要因素就是附睾中的渗透压。附睾中的渗透压偏高渗（400 mOsm），使精子发生脱水现象，导致精子缺乏活动所需要的最低限度水分，故不能运动［12］。黄建国［4］研究了5 个渗透压水平（冰点下降值△t为0.32、0.42、0.52、0.62、0.72和0.82，换算成毫渗透摩尔值分别为183、225、280、333、387和441mmol／L）对猪精液常温保存效果的影响，表明当渗透压为333 mmol／L 时，精液有效保存时间和受胎率均最高。本试验中，最适宜渗透压为345 mmol／L，与黄建国［4］的研究结果基本一致。但蔡元等［5］在对比不同进口稀释液精液保存效果后发现，渗透压为230 mmol／L的BTS液保存效果最好，这与本试验及黄建国［4］的研究结果差距较大。

3.4 缓冲指数对猪精液常温保存效果的影响

精子在代谢过程中会产生CO2而使稀释液pH逐渐降低。精液常温保存稀释液的缓冲能力，尤其是对酸的缓冲能力将直接影响精液保存的效果。目前这方面开展的研究相对较少，尚缺乏理论控制及实际测量方法，本试验开展的工作将对这一稀释液参数的设计和筛选提供参考。通过对比试验发现，当缓冲指数456时精液的保存效果最好。

4 结论

本试验建立的稀释液pH、渗透压和缓冲指数的控制方法准确度分别达到97.1%～99.42%、98.7%～99.68%和98.48%～99.16%，可以满足精液稀释液配方设计的要求。pH 为6.28，渗透压为347mmol／L，缓冲指数为456的9号稀释液精液有效保存时间为160h，保存5d后的精液情期受胎率达到80.5%，与进口的BTS液差异不显著，可以用于实际生产。

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