膀胱癌的靶向治疗及其与miRNA的异常表达

梁 珂，杨 东，欧阳骏

膀胱癌占全部恶性肿瘤的1%～2%，在国内其发病率和死亡率均居泌尿系肿瘤首位。世界范围内，膀胱癌位列男性最常见实体瘤的第4位，在女性列第7位，每年新诊断的膀胱癌患者超过35万例[1]。膀胱癌初次诊断时有70%～80%为非肌层浸润性的，另20%～30%为肌层浸润性的。50%～70%的非肌层浸润性膀胱癌治疗后5年内复发，10%～30%会进展为肌层浸润性膀胱癌[2]。放化疗虽可减轻患者症状，对膀胱癌有一定疗效，但不良反应较严重，且不能实际延长患者的生存期。因此，寻找敏感性及特异性高的膀胱癌标志物，发展以疾病相关生物学基础的靶向治疗已成为当下的研究热点。目前已有大量研究证实miRNA的异常表达与膀胱癌的发生发展密切相关，有可能成为膀胱癌治疗的重要靶点。本文就膀胱癌的靶向治疗与miRNA表达异常的研究进展做一综述。

1 miRNA的分子机制

miRNA属于内源性非编码单链小RNA，由19～25个核苷酸(nucleotide)组成。一个miRNA通常靶向一个或者多个信使RNA(mRNA)，通过与靶mRNA特异的碱基配对引起靶mRNA的降解或翻译抑制，在转录后水平调控基因表达，从而调控细胞分化、生长、增殖、代谢和凋亡等。miRNA与其靶分子组成了一个复杂的调控网络，控制细胞及个体的重要生命活动。正常组织中，miRNA转录、加工，与mRNA特异结合，通过抑制翻译或使mRNA降解而调节基因的表达。如miRNA与其相应的靶mRNA以完全互补的方式结合在开放阅读框，mRNA将发生特异性降解；如miRNA以部分互补的方式结合在mRNA的3′端非翻译区(3′UTR)，则仅仅抑制其翻译，不影响mRNA的稳定性。miRNA的5′端有2～8个核苷酸区被称为“种子区”，对miRNA与mRNA的3′UTR的配对非常重要。miRNA种子区通常和相应的靶序列完全配对，因此可以用种子区序列预测miRNA的靶基因[3]。一种miRNA可作用于多种mRNA靶点，多个miRNA也可协同调控同一个mRNA分子。mRNA的3′UTR可以包含多个miRNA的作用位点，并且与抑制翻译的程度有关，miRNA结合的位点越多，抑制的程度就越大。miRNA是细胞生长和发育过程的调节中起多重作用，是若干细胞进程的重要调节因子，一旦miRNA的表达水平失衡，将可能导致疾病的发生。

2 膀胱癌的靶向治疗现状

膀胱肿瘤发生过程中信号转导通路是很复杂的，通路之间也有交叉，单一阻断某一靶点显然不能对所有膀胱癌患者达到治疗目的。但随着蛋白组学和药物基因组学技术的进步，对导致膀胱癌形成的具体信号通路有了更深入的认识，从而为选择患者进行个体化靶向治疗提供了依据。目前开展的膀胱癌分子靶向治疗主要有：(1)表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号转导通路的靶向治疗[4-5]，如抗EGFR的单克隆抗体曲妥珠单抗和西妥昔单抗；EGFR小分子酪氨酸激酶抑制剂埃罗替尼和拉帕替尼等。(2)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路的靶向治疗[6-7]，如抗VEGF的单克隆抗体贝伐单抗；VEGF小分子酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼和索拉菲尼等[8-9]。(3)P53、Bcl-2、Rb、PIK-3等基因的靶向治疗。(4)miRNA在靶向治疗中的应用。其中，miRNA的靶向治疗被看做是膀胱癌最有前景的治疗方法之一。由于一些miRNA具有重要的抑癌基因的功能，设计基因疗法阻断癌细胞生长和生成有很大前景；另外一些具有癌基因功能的miRNA也可以充分利用，在确定致癌性miRNA序列后，设计合成互补的反义寡聚核苷酸使得miRNA失活，从而可有效的延缓癌细胞的生长。

3 膀胱癌与miRNA表达异常

目前人类基因组中已经鉴定的miRNA有721个，研究发现约50%得到注解的miRNA在基因组上定位于肿瘤发生相关区域和脆性位点，这说明miRNA在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，类似于抑癌基因或癌基因的功能。研究者通过寡核苷酸RNA微点阵分析、磁珠流式细胞计数、实时定量PCR等方法对人类肿瘤中的miRNA进行了表达谱鉴定和功能分析，发现一些miRNA与肿瘤的诊断、分期、进展、预后及对治疗的反应性均有关。Lu等[10]对334例肿瘤及正常组织的miRNA的表达谱进行了分析，发现不同类型的肿瘤、正常组织、以及分化水平相同的细胞均具有不同的miRNA表达谱。通过对肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、膀胱癌及胰腺癌等组织中miRNA谱与正常组织谱的对比分析，发现各种肿瘤具有各自的特征性miRNA。miRNA在膀胱癌中表达异常的原因分析如下：(1)染色体异常，比如染色体重组、扩增、缺失、插入突变等除了会改变蛋白质的编码基因外，也会改变编码miRNA的基因。(2)表观遗传学修饰，表观遗传学修饰在膀胱癌的发生和恶化中有着显著的影响，有3种表观遗传学活动调控肿瘤相关基因，即：肿瘤抑制基因的异常过度甲基化，DNA整体水平的低甲基化和组蛋白的翻译后修饰。(3)miRNA基因的转录调控，转录水平是调控miRNA生物合成和很多作用因子的主要控制阶段。

4 膀胱癌中具有抑癌基因作用的miRNA

抑癌基因是一类调控细胞生长，抑制肿瘤表型表达的基因，编码对肿瘤形成起抑制作用的蛋白质。正常情况下负责控制细胞生长和增殖，而当这些基因不能表达，或者当其产物失去活性时，可以导致癌变。现就膀胱癌中具有抑癌基因作用的miRNA介绍如下。

4.1 miR-23b Majid等[11]发现miR-23b在膀胱癌的细胞株中比在非恶性细胞和正常组织中显著下调。Kaplan-Meier分析揭示膀胱癌患者的miR-23b高表达组具有较高的整体生存期。进一步研究发现，膀胱癌患者miR-23b的高表达可抑制细胞增殖，破坏集落形成。荧光激活细胞分选(FACS)揭示miR-23b的表达通过诱导G0/G1期细胞周期阻滞和凋亡而抑制细胞迁移和侵袭。荧光素酶分析表明E盒结合锌指蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1, Zeb1)是miR-23b在膀胱癌中的作用靶点，Zeb1可调节上皮组织向间质转化。miR-23b下调会促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭，增强miR-23b的表达将是膀胱癌的可能治疗策略。

4.2 miR-409-3p/miRNA-101 越来越多的证据表明某些miRNA的失调有助于肿瘤的进展和转移，Xu等[12]研究发现miR-409-3p在膀胱癌组织和细胞系中明显下调，miR-409-3p在膀胱癌细胞中表达增强能显著减少膀胱癌的转移和侵袭，但不影响细胞的活力，生物信息学分析确定亲转移基因c-Met是miR-409-3p在膀胱癌组织中的潜在靶标，miR-409-3p通过与c-Met的3`端非翻译区结合抑制其表达，静止的c-Met通过小干扰RNA改变miR-409-3p过度表达的影响，c-Met在膀胱癌细胞中的恢复能部分扭转miR-409-3p的抑制，研究还揭示基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9可能是miR-409-3p下游的效应蛋白，这些发现表明miR-409-3p可能是膀胱癌的抑制基因。Hu等[13]发现miRNA-101也是以c-Met为靶标，通过与其3`端非翻译区结合发挥调节作用，miRNA-101的高表达会降低c-Met在mRNA和蛋白水平的表达，最终抑制T24细胞以c-Met依赖方式进行迁移和侵袭，该研究还表明，miRNA-101是新的膀胱癌抑癌基因，通过负调控c-Met抑制T24细胞的迁移和侵袭发挥作用。

4.3 miRNA-100 Xu等[14]应用基因芯片的miRNA阵列检测10对膀胱癌组织的miRNA表达谱，证实了10个差异表达的miRNA发生在任何阶段的膀胱癌组织和癌旁组织。实时定量PCR进行67对膀胱癌组织和10种膀胱癌细胞株的扩大队列验证后，发现miR-100在癌组织中下调最显著。异位修复膀胱癌细胞中miR-100的表达抑制细胞增殖和迁移，在体外诱导细胞周期阻滞，在体内抑制膀胱癌的发生。生物信息学分析表明，mTOR基因是miR-100的靶标。在癌转移的裸鼠模型实验揭示miR-100/mTOR调节细胞运动，并与肿瘤转移相关联。mTOR和p70S6K(下游信使)在原发肿瘤的远处转移灶(如肝脏和肾脏转移)出现较高的表达水平比。因此，miR-100可作为膀胱癌的一种肿瘤抑制基因，通过降低靶基因的表达将成熟的miRNA引入到肿瘤组织中被证明是一种治疗策略。

4.4 其他具有抑癌基因作用的miRNA Zaravinos等[15]对77例膀胱癌组织和77个正常样本进行实时定量聚合酶链式反应，分析1组参与膀胱癌血管生成、肿瘤细胞增殖、抑癌基因抑制、上皮-间质转化和转移激活的miRNA表达谱，结果发现miR-10b，19a，126，145，221，296-5p和378在膀胱癌组织中明显下调，miR-145是本组下调最突出的microRNA。多因素分析表明，miR-378可作为对患者的整体生存的独立预后因素。miR-145，221，296-5p和378组合表现出最好的ROC曲线的特异性和敏感性。这些miRNA可能会作为未来膀胱癌诊断、治疗和预后的候选生物标志物。Chen等[16]研究认为miR-449a是人类膀胱癌的肿瘤抑制剂，miR-449a能够抑制膀胱癌细胞的生长和诱导T24和5637人膀胱癌细胞在G1期阻滞。T24肿瘤异种移植的增长能被外源性miR-449a抑制，使用miR-449a治疗的肿瘤核增殖抗原Ki-67的表达下调。Ichimi等[17]通过转染了miRNA-30a-3p/miRNA133a/miRNA-199a的膀胱癌细胞株，发现KRT7角蛋白的表达减少，进而抑制肿瘤细胞的生长。Huang等[18]发现，miRNA-125b通过减少细胞周期中转录因子E2F3蛋白的表达，抑制E2F3-cyclinA2信号途径，使膀胱肿瘤细胞生长在G1期发生停滞。Bo等[19]首次证实在膀胱癌组织中miRNA-203表达降低，miRNA-203在膀胱癌细胞株中的高表达将抑制细胞的增殖，进一步研究揭示miRNA-203可能通过抑制Bcl-w基因的表达来发挥其抑癌基因的作用。

5 膀胱癌中具有癌基因作用的miRNA

癌基因是一类会引起细胞癌变的基因，癌基因编码的产物与细胞的肿瘤性转化有关。miRNA既可以作为肿瘤抑制基因也可以作为癌基因参与肿瘤的发生和发展。研究发现，在膀胱癌组织中部分类型的miRNA的高表达会促使正常细胞发生癌变。现就膀胱癌中具有癌基因作用的miRNA介绍如下。

5.1 miR-205 上皮-间质转化(EMT)在肿瘤转移中起着重要的作用，EMT的典型特征是上皮标记上皮型E-钙粘蛋白(E-Cadherin,E-cad)的缺失和EMT相关的转录抑制因子Zeb1和Zeb2的表达增加。miR-200家族和miR-205通过抑制Zeb1/2阻止EMT发生。p53基因与miR-200C的调控有关，P53家族和P63亚型ΔNp63α促进miR-205的转录和控制人类膀胱癌细胞EMT发生。在膀胱癌上皮细胞系UM-UC6中敲除ΔNp63α能降低miR-205的表达和诱导表达Zeb1/2，外源性miR-205的表达能逆转该效应。反知，ΔNp63α在“间质性”膀胱癌UM-UC3细胞系过度表达会诱导miR-205，抑制Zeb1/2。抑制ΔNp63α会调低miR-205和miR-205的“主机”(miR-205HG)基因的表达，减少RNA聚合酶Ⅱ和miR-205HG启动子的结合，抑制miR-205HG的转录。Tran等[20]的研究数据表明，ΔNp63α介导的miR-205表达调控膀胱癌细胞的EMT，miR-205为人类膀胱癌的分子标志物，miR-205的高表达预示着膀胱癌患者的临床预后不佳。

5.2 miR-708 Song等[21]用实时定量PCR分析了miR-708在膀胱癌组织和邻近的正常组织的表达水平，用流式细胞术分析细胞的凋亡情况，使用裸鼠为模型对致瘤细胞进行评估，用荧光素酶报告基因检测进行识别miR-708和Caspase-2的mRNA的3′UTR之间的相互作用，用免疫印迹检测Caspase-2的蛋白水平。结果显示，miR-708在人类的膀胱癌组织中经常失控，沉默miR-708能够促进T24和5637细胞凋亡和抑制膀胱肿瘤在体内生长，Caspase-2是miR-708在T24和5637细胞中作用靶点，并参与miR-708调控细胞凋亡。这些结果表明，miR-708是一种致癌基因，并通过下调Caspase-2的水平诱发膀胱癌的致癌性。

5.3 miR-182-5p Hirata等[22]通过在膀胱癌组织中过度表达miR-182-5P发现膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力增加，细胞凋亡被抑制，并证实Smad4(drosophila mothers against decapentaplegic protein)和RECK(reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs)是miR-182-5p的潜在靶基因，在miR-182--5p的抑制剂转染的膀胱癌细胞中靶基因的3′UTR荧光素酶活性显著下降，靶基因的蛋白表达显著上调。miR-182-5P增加核β-catenin的表达，而Smad4抑制核β-catenin的表达。该研究发现miR-182-5p在膀胱癌的表达显著高于正常组织，高miR-182-5p表达的患者总生存期较短，miR-182-5p是膀胱癌的一种重要致癌基因，通过下调RECK和Smad4基因，激活膀胱癌中的Wnt-β-catenin信号通路发挥作用。

6 展望

随着后基因组时代的来临，探索非编码序列的生物学意义日益凸显，miRNA在肿瘤发生发展中的作用更是当前生命科学领域的研究热点。目前研究已证实，miRNA在膀胱癌细胞增殖、凋亡、侵袭、肿瘤血管形成或上皮向间质细胞转化等过程中都发挥着重要的作用。miRNA通过表达上调或下调，发挥抑癌基因或癌基因的作用，虽然目前关于miRNA和膀胱癌的研究尚处于起步阶段，但是miRNA的这种靶向调节作用为膀胱癌的分子诊断和靶向治疗提供了新的切入点。针对靶向细胞或组织特异性较强的小分子物质如miRNA的寡核苷酸及其类似物或激动剂等，改良传统的转染方式，将miRNA作为膀胱癌药物靶向治疗的分子靶点，使膀胱癌的早期诊断分类、优化治疗成为可能，为膀胱癌的诊治开辟一条新的更有效的研究路径。

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