肿瘤相关性巨噬细胞在非小细胞肺癌中的研究进展

白翠青 姚艳雯 宋 勇

巨噬细胞是机体免疫反应中的一种重要细胞，既往认为其可直接杀伤肿瘤细胞或者通过抗原提呈作用诱导机体免疫应答进而清除肿瘤细胞，在抗肿瘤免疫调节中发挥着重要作用。然而，近年来越来越多的研究表明肿瘤微环境中浸润的巨噬细胞即肿瘤相关性巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAMs) 不但不能起到抗肿瘤的作用，相反具有促进肿瘤进展的作用。既往的研究已经提示TAMs的广泛浸润与乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌等的不良预后有关[1-2]。但TAMs在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的作用尚有争议。现就TAMs在NSCLC中的研究进展进行综述。

一、肿瘤相关巨噬细胞

1. TAMs的来源: TAMs是特指聚集在肿瘤微环境中的巨噬细胞，其来源于外周循环血中的单核细胞。肿瘤组织通过释放一些趋化因子，如单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein, MCP-1，又称CCL2)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等，将外周血单核细胞招募进入肿瘤组织内，在肿瘤微环境的诱导下分化形成TAMs[3]。有文献报道TAMs多浸润于肿瘤的缺氧部位，这可能是由于缺氧可提高前列腺素的浓度和TAM对趋化因子的敏感性，进而促进其浸润[4]。

2. TAMs的表型及其分子标志物： 巨噬细胞具有很高的可塑性，在不同微环境的作用下，表现出不同的表型和功能。根据巨噬细胞的活化状态和功能，可分为两种：一种为促炎型即经典活化的巨噬细胞(M1型)，另一种为抗炎型即替代活化的巨噬细胞(M2型)[5]。M1型巨噬细胞由Th1型免疫应答的介质如干扰素(interferon, IFN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)诱导形成。表现较高的抗原提呈能力，释放如白介素-12(interleukin, IL-12)、IL-23等促炎因子，高表达IL-12，低表达IL-10，诱导Ⅰ型免疫应答，对抵御细胞内细菌和病毒及抗肿瘤有重要作用。

M2型巨噬细胞则是由Th2型免疫应答的介质如IL-4和转化生长因子B(transforming growth factor, TFG-B)诱导形成，在血管生成、创伤愈合、组织修复及抗炎等过程中发挥重要的作用。M2型巨噬细胞典型的分子标志包括CD68、CD163、清道夫受体(scavenger receptors, SR-A, 又名CD204)、甘露糖受体(macrophage mannose receptors, MMR，又名CD206)、精氨酸酶1(arginase 1, Arg-1)。M2型巨噬细胞低表达IL-12、高表达IL-10，诱导Ⅱ型免疫应答[6]。

过去几年，Sica和Mantovani等[3,7]指出M1和M2型巨噬细胞共存于肿瘤微环境中，在一定的条件下，TAMs的表型是可以转化的，TAMs可发生M2型活化，呈现M2型巨噬细胞的特征。近几年来多数文献也报道TAMs呈M2型活化表型[8-11]。

二、TAMs在NSCLC中的表型及其与NSCLC预后的关系

Kim等[12]用CD68作为巨噬细胞标志，对144例NSCLC患者手术标本进行免疫组化分析，发现癌巢高密度巨噬细胞的患者比癌巢低密度巨噬细胞的患者生存时间长，5年生存率分别是63.9%和38.9%，多变量分析也发现癌巢巨噬细胞数量是一个独立的预后因素，但该研究未涉及巨噬细胞的表型。Ohri等[13]用CD68作为巨噬细胞的特异性标志物，HLA-DR、 iNOS、MRP 8/14、TNF-α，作为M1型巨噬细胞的标志物，CD163、VEGF作为M2型巨噬细胞的标志物，对40例NSCLC手术标本的癌巢和肿瘤间质巨噬细胞进行了免疫组化分析，结果显示癌巢中M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞共存。在生存期长的患者中，70%癌巢巨噬细胞表现为M1型，38%表现为M2型，癌巢间质的M1型巨噬细胞所占比例明显高于M2型巨噬细胞比例，并且统计分析提示癌巢M1型巨噬细胞数量与预后正相关，而间质的巨噬细胞数量与生存期长短无关。

Ma等[14]用CD68/HLA-DR作M1型巨噬细胞标志，CD68/CD163作M2型巨噬细胞标志，对100例NSCLC患者的手术标本进行免疫组化计数癌巢和间质的巨噬细胞。分析发现在NSCLC中约70%的TAMs为M2型巨噬细胞，30%为M1型巨噬细胞，但无论癌巢、间质或者总M2型巨噬细胞的密度与患者生存期无明显关系，而M1型巨噬细胞的密度(包括癌巢、间质或癌巢和间质的巨噬细胞总数)与患者生存时间呈正相关。

Zhang等[15]用CD68和iNOS作为M1型巨噬细胞的标志物，CD68和MMR作为M2型巨噬细胞的标志物对65例肺腺癌的患者手术标本行免疫组化检测也发现TAMs主要变现为M2型，其数量与预后差相关，但作者并未区分癌巢和间质的巨噬细胞。

Ohtaki等[16]以CD204和CD68作为M2型巨噬细胞的鉴定标志物，对170例手术切除的肺腺癌标本进行免疫组化检测并且结合临床患者资料进行生存分析，发现大多数肺腺癌患者中的间质巨噬细胞表现为CD204和CD68阳性的M2型巨噬细胞，而且其浸润的数量与预后呈负相关。而Carus等[17]用CD163作为巨噬细胞标志，通过免疫组化分析305例NSCLC癌巢和间质的巨噬细胞发现，CD163阳性的巨噬细胞数量与患者无复发生存期和总生存期无明显直接关系。

由此可见，在NSCLC中巨噬细胞的表型及其与预后的关系尚存在争议，这可能与巨噬细胞选用的标志物不统一及临床样本较少有关。综合上述文献研究可初步认为在癌巢中巨噬细胞可能主要表现为抗肿瘤的M1型巨噬细胞，并且其数量与理想的临床预后相关，而间质中的巨噬细胞可能表现为促肿瘤的M2型，且其数量与临床预后较差相关。

三、TAMs与NSCLC的侵袭与转移

1. TAMs促进NSCLC肺癌细胞侵袭： Hirayama等[18]用CD204作为巨噬细胞的标志，对208例肺鳞癌手术患者标本结合临床病理发现，在肿瘤间质CD204巨噬细胞增加的患者中，肿瘤的胸膜侵袭率明显增加。Chen等[19]则通过体外共培养的方法，发现与巨噬细胞共培养后肺癌细胞的侵袭能力和基质降解活性均增加。Wang等[20]从人肺癌组织提取原代巨噬细胞与SPCA1、 H460 和A549等肺癌细胞株体外共培养后发现，这些肺癌细胞的迁移和侵袭能力明显增加，同时实时定量PCR检测到TAMs中IL-10，基质金属蛋白酶-9( matrix metalloproteinases-9, MMP-9)，尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinasetype plasminogen activator, uPA)，VEGF，环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)，血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)，组织蛋白酶(cathepsin K)，和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)基因表达上调。抗uPA单克隆抗体和MMP-9单克隆抗体能够抑制TAMs介导的侵袭能力，进一步说明肺癌细胞侵袭能力的增加可能与MMP-9有关。

2. TAMs与NSCLC的血管生成： 近年来，TAMs在肿瘤血管生成中的作用逐渐受到人们的重视。1996年，Leek等[21]通过TAMs密度与肿瘤血管密度计数发现在乳腺癌中二者呈正相关，提示TAMs可能影响肿瘤血管生成。之后TAMs与血管生成的相关性相继在其他肿瘤中被证实。各种小鼠肿瘤模型为TAMs在肿瘤中促血管生成的作用提供了确定的证据。Bingle等[22]通过在裸鼠皮下分别接种包有巨噬细胞和乳腺肿瘤细胞的琼脂糖体和只包有肿瘤细胞的琼脂糖体，计数两组中琼脂糖周围血管生成的密度，发现含巨噬细胞组与只含肿瘤细胞组相比，前者血管生成明显增加，首次在体外证明了巨噬细胞浸润在肿瘤血管生成中的作用。之后Zeisberger等[23]通过腹腔注射氯磷酸盐脂质体特异性清除小鼠脐胎瘤和横纹肌瘤模型中的巨噬细胞，继而通过免疫组化发现肿瘤生长和血管生成受到明显抑制。

在人肺癌中，Chen等[19]通过计数41例肺癌患者肿瘤内微血管和巨噬细胞的密度，发现TAMs数量和微血管密度呈正相关。但Ogawa等[24]的研究显示肿瘤细胞和间质TAMs中VEGF-C的表达水平与肿瘤大小和血管生成并不相关。Lissbrant等[25]的发现或许可以解释这个问题，他们认为血管生成并非与总的TAMs计数有关，还需考虑TAMs的功能状态(如正在执行的功能是抗原提呈还是血管形成)和其在肿瘤中所处的位置，单纯的TAMs并不是独立的预后因素。

关于巨噬细胞促进肿瘤血管生成的机制如下：①产生促血管生成因子：TAMs表达大量的促血管生成因子，包括VEGF-A和基本成纤维细胞(basic fibroblast growth factor, bFGF)等直接诱导肿瘤内血管生成[26]。TAMs也能产生大量的包括IL-1B、TGF-B1、TNF-a在内的细胞因子,能通过促进肿瘤微环境中的其他类型细胞释放VEGF-A等促血管生成因子，从而间接促进新血管形成[27-29]；②产生基质降解酶：TAMs能产生一些酶，如MMPs-2，-7，-9，-12[30-32]，这些酶改变了细胞外基质(extracellular matrix ，ECM)的结构，促进了活化内皮细胞的黏附、迁移和侵袭能力，进而促进肿瘤血管生成，而且MMPs和ECM相互作用也能增加这些促血管生成因子如VEGF-A和bFGF的活性，间接促进肿瘤血管生成；③TAMs能表达重要的促血管生成酶胸腺嘧啶磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)，该酶已被证实与胃癌有关)，其可促血管生成分子修饰死亡或即将死亡的细胞释放的DNA，进而促进血管生成；④其他：TAMs也能通过其他一些额外的途径促进肿瘤血管生成，这包括募集CD34+AC13内皮细胞或者CD34-CD14+外周血单核细胞[33]。CD14+CD34外周血单核细胞表达有经典的内皮细胞标志VEGFR-2+和血管性血友病因子+(von Willebrand factor +，vWF+)[34]。

3. TAMs与NSCLC的淋巴管生成： 区域性淋巴结转移也是NSCLC的重要转移途径与预后指标之一。淋巴管生成是肿瘤发生淋巴结转移的初始步骤，VEGF-C和VEGF-D是目前发现的最重要的淋巴管生成因子，肿瘤细胞分泌的VEGF-C和VEGF-D均可与及其受体VEGFR-3结合，通过促进淋巴管内皮细胞存活、增殖和迁移介导肿瘤淋巴管生成。

近年来研究发现，TAMs也能通过诱导淋巴管生成促进肿瘤发生淋巴结转移。体外研究证实在小鼠肺腺癌移植瘤中，TAMs主要倾向为M2型巨噬细胞，且M2型巨噬细胞能够通过上调VEGF-C表达和诱导小鼠淋巴管内皮细胞增殖、迁移和管样结构形成等方式促进小鼠肺腺癌淋巴管生成[35]。Zhang 等[36]研究发现人肺腺癌M2型巨噬细胞浸润与TNF分期、微淋巴管密度、淋巴结转移密切相关，与患者总生存期呈明显负相关，其可能原因为M2型巨噬细胞促进了淋巴管生成和淋巴结转移。但Kojima等[37]发现TAMs数量与T1期NSCLC患者VEGF-C、VEGFR-3表达及部分临床病理参数之间均无相关性。Ogawa等[24]对206例I-IIIA期行手术的NSCLC患者分析，发现60.7%的患者肿瘤细胞中VEGF-C表达增高，71.2%的患者间质巨噬细胞中VEGF-C增加，但肿瘤细胞或者间质巨噬细胞的VEGF-C的表达与淋巴结或血管生成无关。多变量分析发现肿瘤内VEGF-C的表达才是有意义的预后因子。可见在NSCLC中，巨噬细胞的促肿瘤淋巴管生成结论尚不统一，有待于进一步的研究。

四、TAMs与肿瘤治疗

TAMs在肿瘤发生发展和临床预后中有重要意义，使它成为一种新的治疗靶点。目前针对TAMs靶向治疗肿瘤的基本策略包括以下几方面：①减少TAMs的募集：TAMs的产生主要是依赖于CSF-1和CCL2等这些细胞因子的调节，通过抑制巨噬细胞的这些趋化因子，减少或阻断巨噬细胞向肿瘤组织的浸润，在一定程度上或许能够抑制TAMs的促肿瘤作用。针对该作用的药物，如CNTO888，是一种能与巨噬细胞的CCR2受体结合的单克隆抗体，正在临床评估阶段[38]；②直接破坏巨噬细胞：直接消除或减少肿瘤微环境中的巨噬细胞，如选用唑来膦酸、氯膦酸盐脂质体等[23]；③逆转TAMs的分化：如使用 CpG DNA 和IL-10 受体抗体能实现巨噬细胞从 促肿瘤的M2型转变成抗肿瘤的M1型[39]; ④抑制TAMs诱导的肿瘤血管生成：众所周知，抑制肿瘤血管生成能抑制肿瘤进展，但是传统的VEGF单克隆抗体如贝伐单抗或者舒尼替尼只能产生短期的效果，甚至有时会导致肿瘤进展[40]，这可能是因为选择性阻断特定的促血管生成因子及其受体并没有完全阻断肿瘤血管生成[41]。TAMs在肿瘤血管生成中也发挥着重要作用，因此开发一些能抑制TAMs释放促血管生成因子的药物，或许能大大抑制肿瘤血管的生成。

综上所述，现有研究已逐渐证实了TAMs浸润在促进肿瘤发展中发挥着重要作用，其中主要机制可能是巨噬细胞能通过释放某些细胞因子和酶促进肿瘤血管和淋巴管的生成，进而促进肿瘤进展。TAMs在NSCLC中的促肿瘤作用，可能为临床有效治疗NSCLC提供了新的靶点，但是目前关于TAMs在NSCLC中的分型及其与肺血管、淋巴管生成之间的关系及预后均未达到一致的认识，仍需要进一步的研究证实。

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