RNA干扰技术在高脂血症实验动物基因治疗中的研究进展

张秀云 宋永砚

高脂血症是心血管疾病(CVD)的主要危险因素，占人群归因危险度的50%以上［1］。降低血脂水平除了调整饮食结构、加强体力活动、改善生活方式外，药物治疗也是非常重要的手段。目前使用的调脂药物包括他汀类、贝特类和烟酸，这些药物的应用为人类心血管疾病的防治作出了巨大的贡献。但是，传统降脂药物存在种类少、价格高、存在毒副作用等不足［2］。RNA干扰现象的发现为降脂药物的研发开辟了一条崭新的道路。高脂血症与一系列脂代谢相关基因的表达异常有关，比如载脂蛋白C-Ⅲ基因高表达导致高三酰甘油血症［3］。将RNA干扰技术用于高脂血症、动脉粥样硬化和CVD的治疗中，目前国外已有一系列研究报道，国内尚处于起步阶段。

1 RNA干扰技术体系

1998年，Fire等［4］首次在对秀丽隐杆线虫的研究中发现了RNA干扰现象，并将导致基因沉默的双链RNA命名为siRNA。RNA干扰技术(RNAi)是在天然RNA干扰现象和理论的基础上发展起来的，是指人工合成并导入与靶基因同源的双链RNA分子(dsRNA)，在细胞内与相应的酶蛋白复合物相互作用，促使靶基因mRNA降解，导致致病基因功能缺失，从而达到疾病治疗的目的。外源dsRNA进入细胞后，在Dicer酶的作用下形成长度为21～23个核苷酸的siRNA，siRNA具有突出的5'-磷酸末端和3'-羟基末端。研究表明，盲端siRNA或缺失5'-磷酸基团的siRNA不能引起基因沉默效应［5］。siRNA中的反义链(与靶mRNA序列互补)与细胞内的相关酶蛋白(包括核酸内切酶和外切酶)结合成基因沉默复合物(RISC)。RISC复合物在反义RNA的引导下，遵循碱基配对原则寻找序列互补的mRNA，在核酸内切酶的作用下切断该互补mRNA，切割部位大约在与siRNA反义链配对序列的中部。随后，mRNA片段被RNA酶进一步降解。

RNAi是转录后水平的基因沉默，不同于反义核酸以及其他形式的基因敲除，其基本特征如下:(1)高效性:RNAi具有放大效应［6］;(2)高特异性;(3)ATP依赖性;(4)浓度依赖性;(5)可传播性;(6)选择性:siRNA只对细胞内成熟的mRNA产生作用，对hnRNA、启动子区域以及其他基因调控区无沉默效应;(7)可修饰性:siRNA可通过胆固醇、磷酸化、生物素等修饰提高其在体内的稳定性［7］。

2 RNAi技术在实验动物高脂血症基因治疗中的研究进展

2.1 siRNA沉默载脂蛋白基因

载脂蛋白是血浆脂蛋白颗粒的蛋白部分，具有稳定脂蛋白结构、激活脂蛋白代谢酶、识别脂蛋白受体等功能。根据与动脉粥样硬化的关系可将血浆脂蛋白分为致动脉粥样硬化性脂蛋白和抗动脉粥样硬化性脂蛋白两大类，致动脉粥样硬化性脂蛋白包括乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和脂蛋白a［Lp(a)］，抗动脉粥样硬化性脂蛋白为高密度脂蛋白(HDL)。在所有致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒中，均含有一分子载脂蛋白 B(ApoB)，CM 含 ApoB48，VLDL、IDL、LDL 和Lp(a)含 ApoB100，ApoB48和 ApoB100来自同一基因(APOB)的转录本，APOB基因定位于人第2号染色体短臂2p23～24，全长43 kb。研究显示，采用RNA干扰技术沉默APOB基因可以有效地降低实验动物血浆三酰甘油和胆固醇水平［7-10］。

2004年，Soutschek等［7］针对 APOB 基因做了以基因干扰为技术手段的开创性研究。研究者们首先设计了84对siRNA，在HepG2细胞中进行筛选，检测发现其中5对siRNA对APOB基因的敲减率达70%以上。选取其中2对(apoB-1-siRNA和apoB-2-siRNA)进行后续实验。为了增强siRNA在体内的稳定性，对siRNA有意义链3'端进行胆固醇修饰，得到 chol-apoB-1-siRNA和 chol-apoB-2-siRNA。修饰后的siRNA在小鼠血清中的稳定性显著增强。chol-apoB-1-siRNA和chol-apoB-2-siRNA通过尾静脉注射入C57BL/6小鼠体内，24 h后肝APOB mRNA分别下降(57±6)%和(36±8)%;空肠 APOB mRNA分别下降(73±10)%和(51±13)%;血浆 ApoB100水平分别下降(68±14)%和(31±18)%。chol-apoB-1-siRNA使小鼠血浆CM下降50%，LDL下降40%，总胆固醇下降(37±11)%，LDL-C下降44%。

裸露核酸片段不易被组织细胞吸收，必须借助于特定的运载体将siRNA运送到靶组织。纳米脂质体(Lipid nanoparticle，LNP)具有安全性高、免疫原性低、操作简单、功能多样等优点。Todin-Strapps等［8］通过筛选后将3对活性较高的APOB siRNA［ApoB:(9331)，ApoB:(10168)和ApoB:(9514)］采用纳米脂质体LNP201包裹，以3 mg/kg的剂量尾静脉注射Balb/C小鼠，72 h后小鼠肝APOB mRNA下降58% ～80%，血清LDL下降47% ～56%。LNP OCD是Merck公司开发的第二代脂质纳米材料。研究者们将其中一对siRNA［ApoB:(10168)］装载入LNP OCD，注射高脂血症模型小鼠，24 h后小鼠肝APOB mRNA下降达95%，72 h抑制率仍保持在90%以上。血清总胆固醇和非HDL显著降低，总脂含量下降70%，肝脂肪酸从头合成途径中的相关基因表达也显著降低。更为重要的是，单次注射即能使药效维持3周以上。这些研究结果被另一项相似的研究［9］所证实。在这项研究中，研究人员将APOB siRNA采用LNP包裹后静脉注射C57Bl/6小鼠，肝APOB mRNA、血清ApoB、胆固醇和三酰甘油水平均显著降低。注射3个星期后，总胆固醇仍下降76% ～84%，非 HDL-C下降79% ～90%，HDL-C下降67% ～78%。当然，使用siRNA沉默APOB基因也带来一些负面作用，比如，APOB基因沉默后肝VLDL颗粒生成减少，脂肪输出受阻而导致肝脂肪变性［8-9］。

2.2 siRNA沉默载脂蛋白受体基因

脂蛋白受体在脂代谢中也发挥重要作用，脂蛋白及其残粒通过肝细胞或组织细胞膜上的受体识别而被摄取。LDL通过低密度脂蛋白受体(LDL-R)对ApoB100的识别而被吞入细胞，LDL-R基因功能缺失是导致家族性高胆固醇血症的原因之一。IDL(VLDL残粒)和CM残粒通过ApoE与肝细胞膜上的受体识别结合而被清除。清道夫受体B类I型(SR-BI)是第1个被发现的HDL受体，存在于肝细胞及固醇类激素合成腺体的细胞膜上。研究表明SR-BI功能缺失会导致阻塞性冠状动脉粥样硬化、自发性心肌梗死和严重的心功能不全［11］。另一方面，SR-BI基因过量表达使高胆固醇血症模型小鼠动脉粥样硬化程度降低［12］。但有趣的是，Demetz等［13］采用siRNA技术将SR-BI基因沉默后发现模型家兔动脉粥样硬化程度显著降低。研究人员以质粒载体为介质将小发夹RNA(shRNA)尾静脉注射动脉粥样硬化模型家兔，每周注射1次，2周后肝SR-BI mRNA下降80%，SR-BI蛋白水平显著降低，胆固醇酯从HDL转移至VLDL/IDL/LDL增强;8周后血浆总胆固醇水平显著降低，动脉粥样硬化程度下降50%。

2.3 siRNA沉默脂质合成相关基因

肝脏是三酰甘油和胆固醇合成的主要场所，通过siRNA技术抑制肝脏三酰甘油和胆固醇从头合成是降低血脂水平的重要方式。VLDL的装配起始于三酰甘油和ApoB100的结合。微粒体三酰甘油转运蛋白(MTP)将三酰甘油转运到ApoB100，形成新生VLDL颗粒。MTP抑制剂可减少肝细胞VLDL分泌，从而降低血浆三酰甘油及胆固醇水平，但同时出现脂肪肝［14］。Tep等［15］采用siRNA抑制 MTP表达，从而抑制VLDL颗粒形成和分泌，同时还采用siRNA沉默甘油二酯酰基转移酶2(DGAT2)，DGAT2是三酰甘油合成途径中的第2个酶，旨在降低血脂水平的同时抑制肝脂肪变性。研究者们将MTPsiRNA、DGAT2 siRNA和MTP siRNA+DGAT2 siRNA分别注射模型小鼠(单次注射)，2周后血浆非HDL-C和三酰甘油均显著降低，但仅MTP siRNA+DGAT2 siRNA联合组未出现肝脂肪变性，提示多基因沉默可能是减小单基因沉默后毒副反应的潜在途径。脂肪酸转运蛋白5(FATP5)存在于肝细胞膜上，其功能是转运长链脂肪酸进入肝脏。FATP5基因敲除小鼠高脂膳食干预后肝脂肪变性程度较对照组显著降低，提示FATP5基因沉默可以抵抗肝脂肪变性。然而，Ason等［9］采用siRNA同时沉默FATP5基因和 APOB基因后，并没有观察到APOB siRNA+FATP5 siRNA联合组较APOB siRNA组或FATP5 siRNA组肝脂肪变性程度降低。

2.4 siRNA沉默脂代谢调节基因

脂代谢受多种蛋白质因子的调节，对调节蛋白的基因沉默可使一些脂代谢相关酶或受体蛋白的数量及活性发生改变，从而降低血脂水平。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是近年来发现的影响LDL-R细胞膜丰度的调节蛋白，其结合在LDL-R上会促使LDL-R降解。PCSK9基因表达降低会增加LDL-R的细胞膜丰度，从而增加组织细胞对LDL的吞噬作用，降低血浆LDL-C水平。Frank-Kamenetsky等［16］针对PCSK9基因设计合成siRNA，纳米脂质体包裹后对C57BL/6小鼠和SD大鼠进行干预，发现PCSK9 mRNA下降50% ～70%，血浆胆固醇水平下降60%。最近，该研究团队在动物试验的基础上开展了PCSK9 siRNA药物的Ⅰ期临床试验［17］，PCSK9 siRNA 以不同剂量(0.015～0.400 mg/kg)静脉注射血清胆固醇升高的健康志愿者。与对照组相比，0.400 mg/kg治疗组血浆PCSK9蛋白水平下降70%，血浆LDL-C水平下降40%。试验过程中未出现毒性反应，耐受性良好。

3 存在的问题、未来发展方向及前景

与RNA干扰技术应用于其他疾病如肿瘤、病毒性感染等一样，siRNA在高脂血症的研究和应用中也存在一些问题，这些问题的出现极大地限制了siRNA作为降脂药物的基础研究和临床应用。存在的问题主要有:(1)脱靶效应。脱靶效应是指siRNA对非靶基因的沉默，是由于siRNA与非靶基因mRNA部分同源以及核苷酸的摆动配对造成的，如G/U错配;(2)体内稳定性较差。(3)转染效率低下。人体组织不易摄取外源裸露性核酸，因而药物siRNA进入靶组织的转染效率较低;(4)存在毒副作用。某些siRNA对人体、组织和细胞存在一定的毒性，毒性反应可能来自于对天然免疫系统的激活以及对非靶基因的沉默。外源siRNA可诱导干扰素(IFNα、IFNβ)和炎症因子(TNFα、IL-6 等)产生，引起淋巴细胞和血小板减少，导致炎症反应［18-19］。siRNA还能够不依赖靶基因对细胞活力产生一定影响，导致细胞凋亡或者生长抑制。siRNA产生毒副作用具有序列特异性和浓度依赖性，高浓度的siRNA可引起细胞基因组表达谱和细胞表型发生改变［20］。

针对siRNA在基础研究和实际应用中存在的问题，未来的研究和发展方向应包括:(1)探索更有效的siRNA设计原则和高通量筛选方法。避开mRNA上容易形成二级结构或高度折叠的区域，避开mRNA上与蛋白质有相互作用的区域如3'UTR和5'UTR，这些区域基因沉默复合物可能无法接近并发挥作用。在符合siRNA设计原则的基础上，针对靶基因mRNA设计尽可能多的siRNA，然后在细胞水平上进行高通量筛选，筛出那些高效、高特异性、副作用小的siRNA进一步研究，以减小脱靶效应和毒副作用;(2)探索更有效的siRNA修饰方式。目前常用的修饰方式有胆固醇修饰、氟代修饰和甲基化修饰等。修饰部位可以在siRNA链的末端或内部;可以对碱基进行修饰，也可以对磷酸核糖骨架进行修饰;(3)探索更有效的给药途径。将siRNA药物有效地传递到靶组织是基因治疗的关键环节。目前常用的给药途径有慢病毒载体、纳米脂质体等;(4)探索多靶点或多基因联合治疗。对一条mRNA的多个靶点，或同时干扰多条相关基因，可以减少抗药性和不良反应，产生协同作用。

近年来，siRNA应用于高脂血症基因治疗的基础研究和临床试验正在广泛而深入地开展。尽管目前还存在一系列有待解决的问题，但随着研究的深入和各种机制的阐明，这些不足之处将能得到妥善解决和有效克服，小核酸药物有望进入临床应用，为高脂血症的治疗开辟一条新的途径。

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