一氧化氮合成酶在不同压力氧气导致的肺型氧中毒中的表达变化*

柳爱姿，包晓辰，方以群，桑仲娜，李华江，张万起△

（1.天津医科大学，天津300070；2.海军医学研究所，上海200433；3.海军司令部航海保证部综合办，天津300042）

临床上经常采用氧气治疗各种缺氧性疾病，高压氧气被用来治疗减压病、股骨头坏死等疾病［1］。但长时间暴露于氧气中会导致氧中毒的发生，其中较为常见的是肺型氧中毒［2］。

目前，认为氧自由基是导致氧中毒发生的主要原因［3］。但最近有文献报道高压氧导致的肺型氧中毒和常压氧（1 ATA，100%氧气）导致的肺型氧中毒存在不同的发病机制，而不同的一氧化氮合成酶（eNOS，nNOS）可能在两种肺型氧中毒中各自起着主要作用［4］。因此Demchenko IT等学者认为两者存在不同的发病机制［5，6］。本文拟通过检测不同压力氧气暴露下大鼠肺组织中eNOS、nNOS的表达变化，探讨常压氧及高压氧导致的肺型氧中毒的不同发病特点。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

60只雄性SD大鼠，体重200 g左右，6周。购买于上海毕凯实验动物公司。实验前1周饲养于海军医学研究所动物中心。动物随机分为6组（n＝10），分别是对照组、1 ATA组、1.5 ATA组、2 ATA组、2.5 ATA组、3 ATA组。

1.2 试剂

eNOS、nNOS抗体购自 Transduction Laboratories公司。BCA蛋白试剂盒购自pierce公司。Gapdh抗体、ECL试剂盒购自santa cruze公司。5x蛋白上样缓冲液购自上海生工。

1.3 氧暴露方案

实验动物置于氧舱中，氧舱内放置CO2吸收剂。100%氧气洗舱10 min后，氧流量监测仪显示氧气浓度大于97%，加压至实验压力。1ATA组暴露56 h、1.5 ATA组暴露20 h、2 ATA组暴露10 h、2.5 ATA组暴露8 h、3 ATA组暴露6 h。

1.4 肺组织湿干比

取右下肺组织，先称取各个肺组织的湿重。然后置于80°C烤箱中烘烤48 h后，称取干重。计算湿／干重的比例（n＝5）。

1.5 支气管肺泡灌洗液蛋白含量测定

每组取5只大鼠，采用戊巴比妥钠麻醉后（100 mg／kg，腹腔注射），逐层剪开皮肤、分离主支气管、剪T型切口。5 ml注射器抽取5 ml预冷的PBS，插入主支气管，结扎固定后，反复抽吸5次，回收率达到60%以上（～3 ml）。收获的支气管肺泡灌洗液1 000，4℃离心10 min后，收集上清储存在70℃冰箱。灌洗液蛋白测定按照Pierce BCA蛋白试剂盒说明书操作。

1.6 Western blot检测凋亡蛋白

动物麻醉后，取肺组织，在蛋白裂解液中裂解（Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA）containing 0.2 mmol／L phenylmethylsulfonyl fluoride（PMSF），0.15μmol／L pepstatin A，20μmol／L leupeptin，and 1 mmol／L sodium orthovanadate后，1 000 g，4°C离心10 min后，取上清，测定蛋白含量。蛋白样品加入5x上样缓冲液，100°C煮沸5 min。等量样品加入电泳槽中，浓缩胶90 V电泳15 min，10%分离胶120 V电泳90 min后。400 mA恒流转膜150 min后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。分别和一抗eNOS、nNOS（1∶1 000），gapdh（1∶8 000）4℃孵育过夜。TBST洗脱15 min×3次后，二抗室温孵育1 h，TBST洗脱15 min×3次，ECL液显影，胶片曝光。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 行为学改变

1.0 ATA组大鼠无明显的氧惊厥等症状，1.5 ATA组及2.0 ATA组大鼠有轻微的运动障碍。2.5 ATA组有1只大鼠（10%）出现抽搐，3.0 ATA组有2只（20%）出现氧惊厥。3.0 ATA组其余大鼠出现呼吸缓慢、肢体抽搐等症状。

2.2 肺湿干比及支气管肺泡灌洗液蛋白量

正常对照组湿干比（4.99±0.15）相比较，1.0 ATA及1.5 ATA氧气暴露组大鼠肺组织的湿干比明显升高，分别是（6.72±0.35）（P＜0.01）和（5.72±0.19）（P＜0.05）。正常对照组肺泡灌洗液蛋白量为（380.84±68.41）μg／ml，1.0 ATA及 1.5 ATA氧气暴露组大鼠支气管肺泡灌洗液中蛋白含量明显升高，分别是（2432.78±651.77）μg／mL（P＜0.05）和（514.36±27.86）μg／mL（P＜0.05）。而 2.0 ATA、2.5 ATA及3.0 ATA组无明显改变。和1.0 ATA氧气暴露组比较，1.5 ATA、2.0 ATA、2.5 ATA及 3.0 ATA氧气暴露组肺组织的湿干比及支气管肺泡灌洗液中的蛋白含量均显著降低（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Comparison of the lung injury score and ratio of wet and dry weight（W／D）and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）albumin concentration levels

Tab.1 Comparison of the lung injury score and ratio of wet and dry weight（W／D）and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）albumin concentration levels

*P＜0.05，**P＜0.01 vs shamgroup；＃＃P＜0.01 vs 1 ATA group

）Sham 4.99±0.15 380.84±68.41 1 ATA 6.72±0.35** 2432.78±651.77*1.5 ATA 5.72±0.19*＃＃ 514.36±27.86*＃＃2 ATA 5.26±0.40＃＃ 548.01±45.40＃＃2.5 ATA 4.99±0.34＃＃ 564.90±92.58＃＃3 ATA 5.43±0.56＃＃ 837.04±289.11 Group W／D Total protein in BALF（μg／mL＃＃

2.3 NOS的表达量

和正常对照组相比较，各个氧气压力暴露组大鼠肺组织中nNOS的含量没有明显改变（P＞0.05）。而eNOS含量则在氧气压力为2 ATA时明显降低（P＜0.05），氧气压力为2.5 ATA及3 ATA时明显增高（P＜0.05，图 1）。

3 讨 论

最近有文献证实常压氧导致的肺型氧中毒和高压氧导致的肺型氧中毒可能存在不同的发病机制［4，5］，而NOS可能在其中起着重要的作用。本研究为了探讨NOS在不同氧气压力导致的肺型氧中毒的表达变化，分别研究了6组不同压力氧暴露下的大鼠肺组织的变化。在实验设计中，不同的压力暴露采用了不同的暴露时间，该实验设计参考了 Demchenko IT等的实验，他们发现1 ATA氧气暴露的半数致死量（LD50）时间为 69 h，1.5 ATA为 24.2 h，2 ATA为 14.2 h，2.5 ATA为 11.2 h，3 ATA为 8.3 h［4］。因此，在本实验中，我们选择了达到半数致死量时间的80%作为各个压力的暴露时间，分别是1 ATA为 56 h、1.5 ATA为 20 h、2 ATA为 10 h、2.5 ATA为8 h、3 ATA为6 h。

Fig.1 Volume changes of the expression of nNOS and eNOS in lung tissue of rats in every group of proteins

本研究结果发现1.0 ATA氧导致的肺型氧中毒主要表现为肺部组织水肿、支气管肺泡灌洗液蛋白含量增高。随着氧分压的增高，上述改变逐渐减弱。和1.0 ATA组相比较，1.5 ATA以上压力组的肺水肿、灌洗液中蛋白含量明显降低，提示常压氧中毒和高压氧中毒可能存在不同的发病机制。这个结果和Demchenko IT等的结果相似［4］，提示随着氧分压的增高，炎症及肺水肿的症状逐渐减轻。

实验结果显示不同氧气压力暴露下nNOS的表达无变化，而eNOS则在2 ATA时明显下降，2.5 ATA及3 ATA时上调明显。提示eNOS在高分压氧导致的肺型氧中毒的发病机制中起着作用。eNOS是表达在内皮细胞上的NO合成酶，在肺组织中广泛表达，有文献证实eNOS在氧中毒发病中起着重要作用［7］，高压氧可增加内皮细胞的eNOS活性及NO的释放［8，9］。Kondrikov等证实肺动脉内皮细胞上eNOS的表达上调可促进高压氧诱导的过氧亚硝酸盐的产生，从而导致肺血管床的亚硝酸应激［9］。

结果表明eNOS在2 ATA时下降明显，而在2.5 ATA及3 ATA时增高。目前认为2 ATA以下的压力导致的肺型氧中毒的发病表现类似于常压氧导致的肺型氧中毒，当压力超过2 ATA时，肺型氧中毒的发病特点出现了明显变化，主要表现为肺部组织出血，而炎症和渗出不明显。因此我们认为eNOS上调可能在超过2 ATA以上的氧气导致的肺型氧中毒中起得作用更大。这需要进一步的实验进行探讨。

总结上述的实验结果，可以看出在达到半数致死量时间的80%作为各个压力的暴露时间，相比于nNOS，eNOS在高分压氧导致的肺型氧中毒中具有重要作用。肺湿干比、支气管肺泡灌洗液蛋白量随着氧气压力的变化而改变。

［1］ Balentine JD.Pathology of Oxygen Toxicity［M］.New York：Academic Press，1982.

［2］ Wispe JR，Roberts RJ.Molecular basis of pulmonary oxygen toxicity［J］.Clin Perinatol，1987，14（3）：651-666.

［3］ Jamieson D，Chance B，Cadenas E，et al.The relation of free radical production to hyperoxia.［J］.Annu Rev Physiol，1986，48：703-719.

［4］ Demchenko IT，Welty-Wolf KE，Allen BW，et al.Similar but not the same：normobaric and hyperbaric pulmonary oxygen toxicity，the role of nitric oxide［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，293（1）：L229-238.

［5］ Demchenko IT，Atochin DN，Gutsaeva DR，et al.Contributions of nitric oxide synthase isoforms to pulmonary oxygen toxicity，local vs.mediated effects［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294（5）：L984-90.

［6］ Demchenko IT，Moskvin AN，Krivchenko AI，et al.Nitric oxide-mediated central sympathetic excitation promotes CNS and pulmonary Oxygen toxicity［J］.J Appl Physiol，2012，112（11）：1814-23.

［7］ Gu X，El-Remessy AB，Brooks SE，et al.Hyperoxia induces retinal vascular endothelial cell apoptosis through formation of peroxynitrite.［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2003，285（3）：C546-554.

［8］ Li LF，Liao SK，Lee CH，et al.Involvement of Akt and endothelial nitric oxide synthase in ventilation-induced neutrophil infiltration：a prospective，controlled animal experiment［J］.Crit Care，2007，11（4）：R89.

［9］ Kondrikov D，Elms S，Fulton D，et al.eNOS-beta-actin interaction contributes to increased peroxynitrite formation during hyperoxia in pulmonary artery endothelial cells and mouse lungs［J］.J Biol Chem，2010，285（46）：35479-35487.