Wnt信号通路在视网膜色素上皮发育中的作用

殷秋菊 赵娉婷 杨春波 李筱荣

Wnt是一个分泌蛋白家族，主要功能是在动物胚胎期调控不同的发育过程。Wnt蛋白通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜上的受体相结合，激活细胞内信号通路调节靶基因的表达，对细胞增殖、分化、迁移、极性化和凋亡起到重要的调节作用。在眼睛的发育过程中，Wnt信号通路主要参与调节眼区的特化、视网膜区域划分、玻璃膜血管形成、角膜及晶状体发育，并维持视网膜干细胞及神经元特性[1]。

RPE是一层高度极化并且特化的单层上皮细胞，位于神经视网膜的光感受器与脉络膜毛细血管网之间。它最主要的功能是参与外层血—视网膜屏障的形成、吞噬光感受器的外节膜盘以保证其更新，并维持与视网膜的黏附、调节离子及水在神经视网膜与脉络膜之间的流动、吸收直射光线阻止视觉形象退化。此外还保护视网膜不受自由基的损害、控制视黄醇类的代谢等。RPE广泛分布于脊椎动物视觉器官，是维持动物眼睛形态与功能正常的重要组成部分[2]。

在RPE的分化过程中，Wnt信号精确定位并适时的表达是保证RPE正常发育分化的前提。尤其是经典Wnt/βcatenin信号通路，对维持并促进背部视网膜特化及其标志性基因的表达尤为重要[3]。Wnt信号通路对眼区的特化及视网膜极性确立过程的调控，以及对视网膜及RPE最终分化成熟以及衰老凋亡的影响机制等是当前研究的重点。

一、Wnt信号通路来源、组成及作用机制：

Wnt信号通路广泛存在于多细胞真核生物中，是一条高度保守的信号通路，在胚胎发育过程中起到重要作用。Wnt基因最早由小鼠乳癌原癌基因及果蝇无翅基因整合而成，而Wnt基因为Wnt信号通路的启动蛋白，此即Wnt信号通路的由来。Wnt信号通路主要由以下蛋白构成：Wnt家族分泌蛋白（Wnt）、β-连环蛋白（β-catenin）、大肠腺瘤样蛋白（APC）等。按照是否需要LRP5/6参与划分，Wnt信号可分为经典Wnt/β-catenin信号通路和非经典途径。经典Wnt信号通路，细胞分泌Wnt蛋白同时与Frz和LRP5/6结合，触发细胞内信号转导，激活Dsh，活化的Dsh抑制β-catenin与Axin-APC-GSK-3β形成降解复合物，使β-catenin在细胞质内积累，然后转移至细胞核内与TCF/LEF相结合，刺激下游靶基因c-myc、cyclinD1、ngn-2等的转录和表达，调控细胞增殖和分化[4]。非经典Wnt途径，Wnt仅和Frz结合，不需要LRP5/6参与，其主要通路有两分支：(1) Wnt/JNk信号通路：Dsh激活Jun-N末端激酶（JNk），调节转录因子 p53、Elkl、DPC4、ATF2 等的活性起作用。(2) Wnt/Ca2+信号通路：通过释放细胞内Ca2+来影响细胞黏附和相关基因表达。在爪蟾早期胚胎中，有多种Wnt基因和Frizzled受体基因表达；LRP5/6受体以及参与Wnt信号转导的β-catenin、APC、GSK3β、CK1、Axin等基因也广泛表达，因而Wnt信号通路在爪蟾早期胚胎发育中发挥着错综复杂的作用。目前已知的作用包括：Wnt/β-catenin信号诱导组织中心的形成[5]，原肠胚时期Wnt/β-catenin信号调控沿头尾轴方向的细胞分化[6]，原肠运动中Wnt/PCP信号调控细胞极性的形成和细胞运动[7]，原肠运动中Wnt/Ca2+信号参与调控细胞粘连和细胞分选[8]，原肠胚到神经胚期间Wnt/β-catenin信号调控神经脊细胞的分化[9]等等。

眼睛是最为精巧的人体器官之一，眼睛发育的同时伴随着中枢神经系统一系列的形态发生，而眼睛结构的精细性和功能的特殊性决定了其细胞形态功能发育的复杂性，相关信号通路网络对这一过程的精确调控有赖于各信号通路及基因的有序表达，表达的时间、位点及表达量的任何异常都可能导致眼发育障碍[10-11]。在这复杂性的背后，是其分子调控机制令人惊异的保守性，从环状对称的腔肠动物如水母，到昆虫类如果蝇，到脊椎动物如小鼠、鸡和人，Wnt信号通路都在眼睛的诱导发育过程中起关键作用[1,12]。

二、Wnt信号通路对胚眼发育及眼区特化的调控

根据现代胚胎学研究结果，人胚胎2周时（长2.6 mm），前脑前端神经褶两侧出现凹陷即视窝（optic pit）。胚胎3周时（长3.2 mm），神经沟封闭，视窝变深，在前脑两侧形成对称的囊状突起，即视泡（optic vesicle），视泡和前脑相通连。逐渐视泡远端扩大，与大脑远离，近脑端较窄形成视茎（optic stalk），即视神经原基。原始视泡向外侧生长，微向前向上倾斜。胚长4.5 mm时，视泡和表皮外胚面接触，与之接触的表皮外胚叶开始形成晶状体。同时视泡的远端和下方逐渐向内凹陷形成视杯（optic cup），由于视杯下方停止生长而内陷，形成胚裂（fetal cleft），中胚叶组织经胚裂进入眼内，视神经纤维经胚裂到达视茎，形成视神经。由此，视杯分为两层，内层厚，形成视网膜神经层，外层始终为一层，形成视网膜色素上皮层。胚裂于12 mm时，由中部开始关闭，向前后延伸，在胚17 mm时完全闭合。当这些变化进行时，晶状体也在发育长大。围绕视杯和晶状体的中胚叶组织形成脉络膜和巩膜的原基。至此，胚眼已具有眼球各部分的雏形[2]。

虽然视泡是最初可见的视觉结构，但越来越多的研究表明，早在间脑外突形成之前，前神经板在尾化因子（caudalizing factors）及IGF作用下诱导前转录因子Otx2的表达，将前神经板特化为四个区域：端脑、间脑、下丘脑及眼区[13]。该神经诱导过程需要多种信号通路及转录因子的参与，包括(1)FGF和Notch信号通路[10,14-15]；(2)时间依赖的经典Wnt/β-catenin信号通路的激活与抑制[16-17]；(3)头蛋白、腱蛋白和卵泡抑素对BMP信号通路的抑制[18-19,36]。其中，经典Wnt/β-catenin途径对下游靶基因的表达调控对于调节眼区和间脑的区域化至关重要。

Cavodeassi等[18]对斑马鱼的研究显示，高水平的Wnt信号表达促进近尾部间脑的特化，而端脑的特化需要抑制Wnt/β-catenin信号。对眼睛的形成而言，高浓度的Wnt/β-catenin信号传导抑制眼睛的发育，使眼域变小。Esteve等[20]报道Wnt信号通路过度激活可能对眼部的发育形成不良影响。而Kim等[21]报道sFRP1过度表达使斑马鱼胚胎头部扩大以及胚胎后部缩小退化，这与Dkk1的过度表达、Fz8a与Wnt8b的显性失活结果类似，并且提出sFRP1很有可能是通过Wnt非经典通路来影响眼区的发育。但是Wnt/PCP (planar cell polarity)信号途径促进眼睛的发育，使眼域变大[13]。Wnt/PCP信号途径不仅抑制Wnt/β-catenin信号途径，而且使眼域的细胞形成一个群体，协调移动和发育[18-19,22-23]。

在眼形成早期，非经典的Wnt信号通路通过Wnt11/Wnt4及其配体Fz5/Fz3，对抗经典Wnt信号通路并诱导眼区标志Rx的表达及细胞向眼区的移行[24]。早在原肠胚形成时期，就能检测到Wnt1和Wnt10b表达于前神经板双边，Wnt8b表达范围更广，距离眼区近尾部仅仅几个细胞，Wnt11主要表达于后部及侧面眼区，且它们的表达范围与最早出现的眼区标志物Rx3的表达范围一致。在原肠胚中期以无水氧化锂激活Wnt/β-catenin信号通路，导致眼区转化为间脑。与之相反，在原肠胚形成中晚期，将Wnt11+细胞移植入Wnt11突变斑马鱼前神经板中，导致大眼表型，进一步的研究发现这是由于Wnt11直接影响了细胞在前神经板中的运动所导致[25]。

综上可见，不同的Wnt受体配体因子在前神经板不同区域差异表达，介导Wnt信号产生时间及区域特异性的生物学效应，是前神经板在神经诱导过程中精确区域化的前提。

三、Wnt与Bmp信号通路共同调节视网膜极性确立

在眼发育的早期，一个很关键的步骤就是确立背—腹和鼻—颞视网膜极性。Eric S.Veien ,Judith S.Rosenthal等发现在斑马鱼视网膜发育中，Wnt信号通路通过活化Bmp信号通路维持背部视网膜相关基因表达。来自于背部RPE的Wnt信号促进背部视网膜表达Bmp配体Bmp4，导致tbx5在背部视网膜分级表达，进而引起Ephrin B的分级表达[26]。在Wnt信号缺失的情况下，Bmp信号能够挽救背部视网膜标志的表达；反之，Wnt却不能在Bmp信号缺失的情况下逆转背部视网膜标志的表达[3,23-24,27]。进一步的研究发现，Wnt信号通过GSK3依赖的Smad蛋白磷酸化作用调节Bmp信号通路维持背部视网膜基因表达[28,36-37]。Sasagawa等[29]证实，小鼠Bmp受体失活导致视网膜背-腹部极性建立紊乱，且异位表达的Bmp4将导致小鸡和非洲爪蟾蜍腹侧视网膜表达背部视网膜标志。对不表达Wnt受体的 Lrp6−/−小鼠的研究表明，在胚胎第 10.5 d，依然未观察到背部视网膜表达Tbx5[30]。

在斑马鱼眼发育早期（12hpf），背部视网膜的特化即已开始，接下来14～16 hpf是维持阶段，该阶段中，Wnt信号通路被激活，其受体TOP:dGFP表达于视泡背部假定的RPE，在神经视网膜并没有检测到其表达。到24 hpf，TOP:dGFP表达于整个RPE直至睫状缘。基因表达谱分析显示，Wnt信号通路对背-腹和鼻—颞视网膜极性确立开始于14～16 hpf，且在整个视泡阶段，Wnt受体仅表达于假定的RPE，在神经视网膜不表达[3,29]。

在眼区的建立过程中，伴随着前神经板及整个CNS的形态改变，Wnt和Bmp信号通路有序配合共同调节背部视网膜相关基因的表达。这种针对不同信号通路的组织及时间特异性调整策略广泛存在，这是由于受到相邻组织诱导性生长因子影响所致，使得同一信号通路的最终作用结果在不同的组织表现出极大的差异。这对视网膜极性的确立及进一步分化为神经视网膜和RPE至关重要。

四、Wnt信号通路通过Otx和Mitf调节RPE的分化成熟

在发育的早期，RPE及RN两种细胞共同表达一些对它们将来分化所必需的转录因子，如Rx，Mitf，Otx2等，这些因子诱导视泡嵴侧的细胞向RPE分化。随后Rx仅在RN细胞中表达，而Mitf及Otx2仅在RPE细胞中表达[2-3]。

在小鼠RPE早期发育过程中，转录因子Pax6最初高水平的表达于神经视网膜及RPE，而在发育后期，Pax6在RPE的表达逐渐降低直至消失。研究证实Pax6抑制了Fgf15及Dkk3的表达，而Dkk3联合FGF通过抑制经典Wnt信号通路促进RPE转分化为神经视网膜[21,31]。

Otx1/2和Mitf是诱导RPE发育分化的两个主效基因，Mitf调控色素合成途径分子的表达，如酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白Trp1，Trp2等。Mitf缺乏会导致RPE细胞不能形成，在RN细胞中表达Mitf会引起其色素化。Mitf突变小鼠表现为视网膜组织结构紊乱、反常的折叠及在视网膜和突变的RPE之间形成桥状结构，同样，在Otx2突变小鼠中，RPE也不能形成。在鼠眼发育中，干扰Otx1/2和Mitf两者中任何一个都将导致小眼（出生后）或眼缺损（胚胎期）[32]。研究表明Mitf及Otx2通过调节不同的顺式序列而影响下游基因如Dkk3的表达，因此它们是互相独立而又协调作用的两个因子[33]。

Peter Westenskow，Stefano Piccolo等对小鼠进行的研究发现，β-catenin的缺失导致RPE转分化为视网膜样结构，突变的RPE间黏着连接位置紊乱，其表现类似于纯合子Mitf突变小鼠(Mi/Mi)[34]，并伴有Otx2和Mitf表达下调及视网膜标志Chx10和Rx表达上调[26,35]。进一步的实验证实，β-catenin通过与Otx2和Mitf增强子TCF/LEF位点结合而发挥作用。β-catenin的缺失导致Mitf表达下调，引起细胞间黏附缺陷显著[34]。此外，Wnt/ β-catenin可直接反式激活Mitf-M启动子，从而促进神经嵴细胞向上皮细胞分化[36]。反之，Mitf也可直接与β-catenin结合，反馈调节Wnt/β-catenin信号通路。这表明Mitf既是Wnt/β-catenin信号的调节目标，同时也是该通路的一个调节者[10,21]。而Cho和Cepko等[37]发现，在假定的神经视网膜异位激活Wnt/β-catenin信号通路，并不足以诱导出RPE样细胞，表明有额外的因子在其中发挥作用。综上分析，Otx1/Otx2以及Pax6的活化启动RPE早期特化，Pax6联合Wnt信号通路促使Mitf开始表达，Mitf与Otx蛋白协同作用，促进RPE的分化[1,3,10,20]。

在RPE发育分化后期，RPE的成熟需要完成其功能上的极化，这是通过膜内蛋白从细胞顶部至基部的差异分布来实现的。Ανβ5整合蛋白、甘露糖受体和CD36位于RPE顶部膜区，特别是在微绒毛处，对光感受器外节膜盘吞噬起关键作用。Na+K+ATP酶也在顶部表达，对从脉络膜穿越到视网膜的主动性钠流入是不可缺少的。RPE基底质膜则以内折叠为特征，表达 α3β1，α6β1，ανβ3 等整合素并介导RPE附着于Bruch膜[2,30]。对RPE的体外培养发现，由β-catenin联合钙粘素共同参与调节细胞骨架的重排、上皮间连接的形成、成熟及维持。而β-catenin是经典Wnt信号的中心调节者，表明Wnt信号参与了这一过程[1,10,38]。

五、结论与展望

RPE的发育分化是一个受到精细调控的过程，Wnt信号通路协同其他调控因子如TGF β/activin和sonic hedgehog信号通路，决定了背部及腹侧视泡细胞的RPE命运[2]；Bmp信号通路与Wnt共同参与调节动物胚胎CNS及眼的发育[39]。各信号通路间互相调控构成一个复杂的网络，共同调节RPE各阶段的诱导分化。而经典Wnt/β-catenin信号通路对胚胎期RPE的分化发育成熟起了重要作用，在成体RPE抗氧化损伤、衰老及凋亡中也扮演了重要角色。对于Wnt/β-catenin信号通路配体的来源及该通路与其他调节RPE发育的信号通路之间相互调控机制的探索，必将为进一步深入了解RPE发育的分子机制，乃至更加高效地利用干细胞定向诱导获得RPE细胞提供重要依据。

1 Lad EM,Cheshier SH,Kalani MY.Wnt-signaling in retinal development and disease[J].Stem Cells Dev,2009,18(1):7-16.

2 Stephen J Ryan,David R Hinton,Andrew P Schachat.RETINA[M].4th Edition.New York: Elsevier,2011,3-21:138-154.

3 Veien ES,Rosenthal JS,Kruse-Bend RC,et al.Canonical Wnt signaling is required for maintenance of dorsal retinal identity[J].Development,2008,135(24):4101-4111.

4 Arce L,Yokoyama NN,Waterman ML.Diversity of LEF/TCF action in development and disease[J].Oncogene,2006,25(57):7492-7504.

5 HeasmanJ.Maternal determinants of embryonic cell fate[J].Semin Cell Dev Biol,2006,17(1):93-98.

6 Yamaguchi T.Heads or tails: Wnts and anterior-posterior patterning[J].Curr Biol,2001,11(17):713-724

7 Leptin M.Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts[J].Dev Cell,2005,8(3):305-320

8 Winklbauer R,Medina A,Swain R K,et al.Frizzled-7 signalling controls tissue separation during Xenopus gastrulation[J].Nature,2001,413(6858):856-860

9 Barembaum M,Bronner-Fraser M.Early steps in neural crest specification[J].Semi Cell Dev Biol ,2005,16(6):642-646

10 Westenskow P,Piccolo S,Fuhrmann S.β-catenin controls differentiation of the retinal pigment epithelium in the mouse optic cup by regulating Mitf and Otx2 expression[J].Development,2009,136:2505-2510.

11 Asai-Coakwell M,French CR,Berry KM,et al.GDF6,a novel locus for a spectrum of ocular developmental anomalies[J].Am J Hum Genet,2007,80(2):306–315.

12 de Iongh RU,Abud HE,Hime GR.WNT/Frizzled signaling in eye development and disease[J].Front Biosci,2006,11:2442-2464.

13 Ekker SC,Ungar AR,Greenstein P,et al.Patterning activities of vertebrate hedgehog proteins in the developing eye and brain[J].Curr Biol,1995,5(8):944-955.

14 Wei S,Xu G,Bridges LC,et al.Roles of ADAM13-regulated Wnt activity in early Xenopus eye development[J].Dev Biol,2012,363(1):147-154.

15 Burns C,Zhang J,Brown E,et al.Investigation of Firzzled-5 during embryonic neural development in mouse[J].Dev Dyn,2008,34(9):123-126.

16 Fuhrmann S,Riesenberg AN,Mathiesen AM,et al.Characterization of a transient TCF/LEF-responsive progenitor population in the embryonic mouse retina[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2009,.50(1): 432-440.

17 Dorsky RI,Snyder A,Cretekos CJ,et al.Maternal and embryonic expression of zebrafish lef1[J].Mech Dev,1999,86(1-2):147-150.

18 Cavodeassi F,Carreira-Barbosa F,Rodrigo M,et al.Early Stages of Zebrafish Eye Formation Require the Coordinated Activity of Wnt11,Fz5,and the Wnt/β-Catenin Pathway[J].Neuron,2005,47(1):43-56.

19 Bharti K,Gasper M,Ou J,et al.A Regulatory Loop Involving PAX6,MITF,and WNT Signaling Controls Retinal Pigment Epithelium Development[J].PLoS Genet,2011,8(7):1002-1009.

20 Esteve P,Lopez-Rios J,Bovolenta P.SFRP1 is required for the proper establishment of the eyefield in the medakafish[J].Mech Dev,2004,121(7-8):687-701.

21 Kim HS,Shin J,Kim SH,et al.Eye field requires the function of Sfrp1 as a Wnt antagonist[J].Neurosci Lett,2007,414(1):26-29.

22 Briscoe J,Novitch BG.Regulatory pathways linking progenitor patterning,cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2008,363(1489):57–70.

23 Hsu SC,Galceran J,Grosschedl R.Modulation of transcriptional regulation by LEF-1 in response to Wnt-1 signaling and association with beta-catenin[J].Mol.Cell.Biol.2008,18(8):4807-4818.

24 Delot E,Kataoka H,Goutel C,et al.The BMP-related protein radar: a maintenance factor for dorsal neuroectoderm cells[J].Mech Dev,1999,85(1-2):15–25.

25 Park K,Lee K,Zhang B,et al.Murray and Jian-xing Ma.Identification of a Novel Inhibitor of the Canonical Wnt Pathway[J].Mol Cell Biol,2011,31(14):3038–3051.

26 Veien ES,Rosenthal JS,Kruse-Bend RC,et al.Canonical Wnt signaling is required for the maintenance of dorsal retinal identity[J].Development,2008,135(24):4101-4111.

27 Chocron S,Verhoeven MC,Rentzsch F,et al.Zebrafish Bmp4 regulates left-right asymmetry at two distinct developmental time points[J].Dev Biol 2007,305(2):577-588.

28 Fuentealba LC,Eivers E,Ikeda A,et al.Integratingpatterning signals: Wnt/GSK3 regulates the duration of the BMP/Smad1 signal[J].Cell,2007,131(5):980-993.

29 Sasagawa S,Takabatake T,Takabatake Y,et al.Axes establishment during eye morphogenesis inXenopus by coordinate and antagonistic actions of BMP4,Shh,and RA[J].Genesis,2002,33(2):86-96.

30 Maretto S,Cordenonsi M,Dupont S et al.Mapping Wnt/beta-catenin signaling during mouse development and incolorectal tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(6):3299-3304.

31 Clegg DO,Buchholz D,Hikita S,et al.Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration[J].Stem Cell Res Ther,2008,1:1-24.

32 Martinez-Morales JR,Signore M,Acampora D,et al.Otx genes are required for tissue specification in the developing eye[J].Development,2001,128(11):2019-2030.

33 Bharti K,Liu W,Csermely T,et al.Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF[J].Development,2008,135(6):1169-1178.

34 Bumsted KM,Barnstable CJ.Dorsal retinal pigment epithelium differentiates as neural retina in the microphthalmia (mi/mi) mouse[J].Ophthalmol,2000,41(3):903-908.

35 FuX,Sun H,Klein WH,et al..Beta-catenin is essential for lamination but not neurogenesis in mouse retinal development[J].Dev Biol,299(2):424-437.

36 Schmidt C,Patel K.Wnts and the neural crest[J].Anat Embryol (Berl).2005,209(5):349-355.

37 Cho SH,Cepko CL.Wnt2b/beta-catenin-mediated canonical Wnt signaling determines the peripheral fates of the chick eye.[J].Development,2006,133(16):3167-3177.

38 Burke JM..Epithelial phenotype and the RPE: Is the answer blowing in the Wnt[J]? Prog Retin Eye Res,2008,27(6):579-95.

39 Behesti H,Holt JK,Sowden JC.The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup[J].BMC Dev Biol,2006,6:62.