隐孢子虫检测方法研究进展

张 冰，张 杰，许 杰，何惠君，巴图艾德尼

（1.新疆医科大学基础医学院病原学教研室，乌鲁木齐 830054；2.新疆医科大学临床医学2010-2班；3.新疆医科大学临床医学2011-6班）

隐孢子虫检测方法研究进展

张 冰1，张 杰2，许 杰2，何惠君3，巴图艾德尼3

（1.新疆医科大学基础医学院病原学教研室，乌鲁木齐 830054；2.新疆医科大学临床医学2010-2班；3.新疆医科大学临床医学2011-6班）

隐孢子虫是一种能引起人、畜和野生动物共同感染的原虫。由于隐孢子虫卵囊很小，在光镜下观察缺乏明显的特征，检测比较困难，为寻找高效的检测方法，国内外学者在隐孢子虫检测方面进行了大量的研究。文章综述了近年来用于检测隐孢子虫的主要方法，并初步分析了各种方法的优、缺点。

隐孢子虫；检测方法

隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）是体积微小的球虫类寄生虫，可寄生于包括人在内的各类脊椎动物消化道上皮细胞、消化道，引起腹泻等症状；同时，在肠外其他部位感染或自身感染，如口腔、眼结膜、阴道、子宫、呼吸道、胆囊、淋巴结和睾丸等部位。

近年来，国内外学者做了大量的研究工作，已建立了该病的病原学、分子生物学、免疫学等检测方法。本文从3个方面就这些检测方法作一综述。

1 隐孢子虫的传统检测方法

1.1 镜检法

周圣文等［1］用饱和蔗糖漂浮法检测小白鼠粪便中的隐孢子虫，之后又进行了犊牛的隐孢子虫调查。目前除用上述方法外，还有饱和盐水、饱和硫酸镁、饱和硫酸锌、甲醛-乙醚沉淀法、甘油漂浮-G3耐酸漏斗过滤浓集法等。研究证明，所有漂浮法中饱和蔗糖法和甘油漂浮-G3耐酸漏斗过滤浓集法的回收率相近，但由于饱和蔗糖的粘度较大，卵囊不易与杂质分离，所以卵囊纯度不高。

1.2 染色法

1.2.1 金胺-酚染色法［2］新鲜或甲醛固定后的标本均可采用此法，染色后在荧光显微镜下观察。此法简单、敏感，适用于批量标本的初筛。

1.2.2 改良抗酸染色法［3］此法是隐孢子虫检测中较常用的方法［4］，但由于在粪便中存在红色抗酸颗粒和一些易染成红色的相似原虫，很难鉴别，造成特异性降低。

1.2.3 金胺-酚改良抗酸复染法 韩范等［5］将金胺-酚染色法与改良酸染色法结合，使检测的敏感性和卵囊检出率提高。目前，该方法被广泛应用于隐孢子虫病的流行病学调查和诊断中。

1.2.4 血清混合粘附法 由于采用镜检的大多数标本通过2.5%的重铬酸钾保存、涂片染色、自来水冲洗，易造成假阴性，因此目前采用血清混合粘附法来解决此问题。血清混合粘附法先在玻片上滴加一滴血清，然后加上粪液与血清混匀、涂片，进行染色。此法明显提高了其他染色方法的的阳性检出率，对隐孢子虫病的流行病调查诊断及研究都有重要意义。

2 隐孢子虫免疫学检测方法

2.1 免疫荧光检测

免疫荧光检测有直接免疫荧光测定（direct immunofluorescence assay，DFA）和间接免疫荧光测定（indirect immunofluorescence assay，IFA）两种技术。许多隐孢子虫单克隆抗体识别的抗原表位在卵囊表面，基于单克隆抗体可与卵囊壁的特异性结合反应，可以用DFA和IFA来检测粪便涂片和环境样品中的卵囊［6］。该法特异性强、灵敏度高，国外已经制备出相应的商品化试剂盒［7］。

2.2 酶免疫分析法

酶免疫分析法（enzyme immunoassay，EIA）分为均相和非均相两种类型，非均相较常用，包括液相与固相免疫测定法，固相免疫测定法的代表技术是酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。

EIA可作为检测HIV阳性或艾滋病患者粪便样品中的隐孢子虫特殊粪抗原的免疫学方法。

目前，国外已有EIA商品化试剂盒，是用酶标记抗体来检测抗原，用于检测粪便样品中的隐孢子虫卵囊［8］。

2.3 免疫层析法

免疫层析法（immunochromatography，IC）为实验室提供了方便的检测粪便样品中卵囊的方法。据报道特异度高达98%～100%，在无症状感染及检测不到卵囊的病例中应用，意义重大［9］。Chan等［10］证明IC的敏感性与染色方法相同甚至更好。目前国外已研制出IC商品化试剂盒，用来检测粪便样品中的卵囊抗原。

2.4 酶联免疫电转印

酶联免疫电转印（enzyme-linked immunoelectrotransfer blot，EITB）又称Westem免疫印迹试验，该法可以从大分子多肽水平对隐孢子虫抗原组分及其免疫活性进行检测和分析，已用于隐孢子虫病的临床诊断及特异性抗原和抗体的分析［11］。有报道采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出的相对分子质量（Mr）为23 000的隐孢子虫子孢子抗原。随着技术的完善，EITB可望成为高度敏感和特异的诊断隐孢子虫病和区别隐孢子虫感染期的有效方法。

2.5 免疫磁珠分离法

免疫磁珠分离法（immunomagnetic beads separation，IMS）虽然不是常规的临床和兽用诊断技术，但是当研究一些特殊的感染病例，尤其是在临床症状和流行病学风险因子怀疑指标很高的情况下，则选用IMS方法［12］。

2.6 流式细胞仪技术

流式细胞仪（flowcytometry，FC）技术适用于大规模的样品检测，特别是感染程度较低和无症状带虫者的检测，并且还可以用于检测卵囊的活力［13］。

理想的隐孢子虫的免疫学检测方法，应有足够的敏感性，能检测出绝大多数感染宿主；有很好的特异性，很少与其他寄生虫发生交叉反应，健康动物无假阳性；方法简便易行，经济快捷，可在基层推广应用。目前，国外已有多种免疫学检测的商品化试剂盒上市，在粪便、水质、食物和环境样品检测中得到广泛应用。国内已建立了多种隐孢子虫免疫学检测方法，同时有些技术仍未完善，有待进一步改进和提高。

3 隐孢子虫分子生物学检测方法

3.1 基因分型标记

3.1.1 基因型分型工具 自Laxer首次运用PCR技术检测粪便样品中隐孢子虫以来，许多研究者均以PCR方法检测临床及环境样本中的隐孢子虫卵囊。目前，常作为分子标记的基因位点主要有小亚基核糖体rRNA（SSUrRNA）、70-kDa热休克蛋白（HSP70）、卵囊壁蛋白（COWP）、肌动蛋白（actin）、乙酰辅酶A合成酶、二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶（DHFR-ts）、血小板反应蛋白-相关黏附蛋白（PRAP-C1和PRAP-C2）等编码基因，以及一些微卫星序列（SSR-1）［14］。

3.1.1.1 18S rRNA基因 隐孢子虫18S基因具有高度保守性，易于PCR引物设计，几乎能鉴别区分所有隐孢子虫种类，是目前运用最广的基因位点之一［15］。早期隐孢子虫种大都基于18SrRNA基因鉴定而命名，后来经其他基因位点鉴定仍然成立。

3.1.1.2 HSPs热休克蛋白家族（heat shock proteins，

HSPs）在隐孢子虫基因型检测中应用较广。通过对该位点补充分析，已确立许多独立种和基因型。Feng等［16］运用HSP90基因位点，成功建立了一套基因分型方法，该方法能准确区分感染人的隐孢子虫种。

3.1.1.3 actin基因 肌动蛋白与18SrRNA基因分析结果相一致，但对卵囊量较小的BTP2分析，actin位点未能扩增出目的片段。因actin基因位点同一基因型内变异小，从而限制其广泛运用［17］。

3.1.1.4 cowp基因 Leoni等［18］在英国历行15年的流行病学调查研究中，发现2例C.andersoni，利用18S rRNA和cowp基因的序列分析，均为C.andersoni。由于其特异性差，基于cowp基因的分型工具应用相对较少。

3.1.1.5 微管蛋白β 微管蛋白（β-tubulin）基因微管已被用于原生动物的各级分类水平上的系统发育研究。这种方法可特异地分辨出C.parvum基因I型和Ⅱ型,且敏感性高，单卵囊即可检出。

3.1.1.6 其他基因 在检测C.parvum基因型方面，基于DHFR基因的多重等位基因特异性PCR（MAS-PCR）方法和cowp基因PCR-RFIP与18SrRNA基因巢氏RFIP方法具有同样的敏感性和特异性，并能检测到多种基因型感染。

3.1.2 基因亚型分型标记 随着分子生物学研究发展，亚型分析工具越来越多地应用于流行病学调研。基因亚型分型工具发展过程中主要使用以下遗传性靶基因位点，包括微卫星和小卫星、60 kDa糖蛋白（GP60）基因、双链RNA成分（ds-RNA）和rRNA内部转录间隔区（ITS-2）。

3.1.2.1 GP 60基因 GP 60是隐孢子虫基因组中最具多态性的标记基因，是应用最广泛的隐孢子虫亚型靶基因。GP 60基因序列分析在C.parrum人和牛基因型发现有近100个GP 60基因亚型，表明这项技术具有非常高的分辨力。

3.1.2.2 微卫星序列 Strong等［19］发现C.hominis分离株的4个等位基因，在每个等位基因内，根据多个三联核苷酸串联重复分为不同基因亚型。因此，微卫星位点分析对于隐孢子虫流行病学、传播途径及种群结构研究很有帮助。

3.1.2.3 ds-RNA和转录间隔子ITS ds-RNA和ITS-2的SSCP序列分析也用于C.parvum和C.hominis亚型分析。ITS分为ITS-1和ITS-2两个区域，ITS-2（GenBank assession no．AF015774）含有5个拷贝数的高度变异区域最适合基因亚型分析［20］。Tiangtip等［21］对隐孢子虫MS2、MS3和MS4基因进行研究，其序列分析表明CR2和CR9分离株属于C.meleagridis，它们有相同的ITS序列；而CR8属于C.muris，ITS存在差异。

3.1.2.4 其他位点 其他位点在C.homimis、C.parvum、C. meleagridis多位点分析（MLST）方面，6号染色体上GP60、CP47、CP56、TSP8（ML2）、RPGR、Mucinl、CP56、MSC67、DZ-HRGP、ZPT等位点，2号染色体上HSP70小卫星位点等均具有较高特异性［22］。

3.1.3 工具酶 目前尚无隐孢子虫种类鉴定的标准遗传位点。构建隐孢子虫DNA限制性内切酶图谱通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置，从而鉴定隐孢子虫种［16］。

运用分子生物学技术进行隐孢子虫的研究已极大地提高了人们对隐孢子虫的认知水平，隐孢子虫基因分型标记的发展，对于理解隐孢子虫生物学、从基因型和亚型水平上理解隐孢子虫的传播途径、群体结构和宿主相互作用机制及流行病学具有重要的作用［23-24］。

3.2 分子检测技术

3.2.1 常规PCR PCR在检测水和粪便中隐孢子虫卵囊方面比免疫荧光检测等免疫学试验有更高的敏感性和特异性。向飞宇等［25］利用PCR技术检测奶牛粪便中的隐孢子虫，可检测出含卵囊445个/mL的样品，其灵敏度与常规检测相比有很大提高。

3.2.2 套式PCR（nested PCR） 套式PCR又称巢式PCR，极易受到污染，假阳性率高，实验结果的稳定性受到影响，因而对实验环境和操作人员要求较高。

Ryan等［26］以18SrRNA高变区内一段长434 bp的寡核苷酸为靶基因建立的套式PCR方法成功地用于检测河水、地表水和污水中的隐孢子虫，敏感性极高。张龙现等［27］采用套式PCR方法以18SrRNA为靶基因检测粪便中的微量隐孢子虫，最低可检测到2.86个卵囊/g粪便。

3.2.3 实时PCR（Real time PCR） Real time PCR最早由Higuchi于1992年提出，具有操作简单、快速、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，通过Real time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理。

Guy等［28］设计的Real time PCR方法可以检测出1个隐孢子虫卵囊的DNA含量。Fontaine等［29］将免疫磁性分离（immunomagnetic separation，IMS）技术与Real time PCR技术相结合，建立了IMS-Real time PCR方法，该方法最低能够在20 L自来水中检出5个隐孢子虫卵囊以及在5 L塞纳河水中检出8个卵囊。

3.2.4 反转录PCR（reversetranscriptionRT-PCR）Stinear等［30］采用寡dT25包被的磁珠捕获隐孢子虫卵囊HSP mRNA作RT-PCR，可以检测出水样中的1个活卵囊。Fontaine等将Real time PCR技术与RT-PCR技术结合

起来，建立了Real time RT-PCR方法，以隐孢子虫18S rRNA基因作为靶基因进行检测，最少能够检测出5个活卵囊。

3.2.5 细胞培养 PCR（cell cultivation-PCR，CC-PCR）

目前，微小隐孢子虫（C.parvum）、人隐孢子虫（C.hominis）、鼠隐孢子虫（C.muris）、安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫（C.baileyi）等已在体外成功培养。

3.2.6 最大可能数 PCR（most probable number-PCR, MPN-PCR）MPN-PCR检测的整个过程可在几小时之内完成。Carey等［31］建立了一种MPN-PCR方法，该方法检测效果优于 MPN-foci检测法（foci detection method，FDM），特别适合于环境水样中微小隐孢子虫的活性检测。

3.2.7 PCR-随机扩增多态性DNA（PCR-randomamplified polymorphic DNA，PCR-RAPD）技术 该技术以PCR技术为基础。该方法的缺点是可重复性较差，不同实验条件下的结果不具有可比性。反应条件的细微变化或使用不同的PCR扩增仪可能使实验结果不一致。因此，PCR-RAPD技术因其自身存在的一些不足而使其应用受到一定的限制。

田宗成等［32］对微小隐孢子虫进行PCR-RAPD分析，找到了鉴别微小隐孢子虫的特异性引物。Morgan等利用PCR-RAPD技术将微小隐孢子虫区分为人型和畜型2个基因型，并检出两者的差异性。

3.2.8 PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术

与RFLP相比，PCR-RFLP优点在于大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且对样品纯度要求不高，简便快速，特异性强，也不需要用放射性标记探针做杂交，可直接用EB染色法检测，适用于个体分析。此外，还可以揭示种间及种内不同基因型间DNA水平的全部差异，为各种基因提供紧密连锁的标志。目前，PCR-RFLP已广泛应用于各种寄生虫的分类鉴定、诊断与防治上［33］。该方法的缺点是酶切条件要求较高，区分所有等位基因比较困难，且无法分辨杂合子，只能区分有限的多态性。

3.2.9 PCR-单链构象多态性（PCR-single strand comformation polymorphism，PCR-SSCP）技术 该方法不但用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析和多个标本的筛查，具有简便、快速、灵敏、耗费低等优点。

近年来，非同位素方法的发展使PCR-SSCP技术在临床检测中的应用越来越广泛。Gasser等［34］利用PCRSSCP技术检测微小隐孢子虫，能够区分出人型与牛型的差异。

3.2.10 核酸序列依赖的扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技术 该方法是一种连续等温体外特异性核酸扩增反应，只需在一种温度下就可完成反应，不像普通PCR需要3个温度，因此同一时间内拥有更高的扩增效率。NASBA技术还具有操作简便、不需特殊仪器、检测时间短等优点。

3.2.11 基因芯片技术 目前，国外已有多种用于临床检测的基因芯片，只是价格昂贵，限制了实际的推广应用，还有待于进一步优化和完善，提高其实用性和可操作性。

随着分子生物学技术的迅速发展，隐孢子虫分子检测技术也日臻完善。以PCR为代表的分子检测技术相对于传统的组织活检、漂浮法、密度梯度离心法等方法来说，具有快速、准确的优点，不但可用于临床大批量样品的检测，还可以针对隐性带虫者、症状轻微者进行检测，采用合适的引物，还可以区分不同的虫种和基因型。基因芯片技术则具有同时检测多种样品、分析速度快、所需样品量少、污染少等优点，未来将会发展成为一项规模化的分子检测技术。

4 展望

隐孢子虫病至今还没有一种有效药物进行治疗，在免疫缺陷机体中可造成严重腹泻，也是目前艾滋病直接死亡的主要病原之一。因此，预防隐孢子虫病十分重要，其中检测技术的研究是众多环节中最有价值的一项工作。传统方法和分子生物学方法都有各自的特点，很多学者都进行过比较。由于传统的检测方法对染色技术以及鉴定人员的经验要求很高，存在很大的局限性，而分子生物学的检测方法则以其精确度高、特异性强等特点得到了广泛应用。随着现代科技的发展，计算机技术与PCR技术的结合,基因检测工具的应用与发展都将推动人们对人和动物隐孢子虫病的认识和理解。

致谢：本文承蒙石河子大学动物科技学院张居农教授的校正指导，特此感谢！

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Progress in the Detection Methods for Cryptosporidium

ZhangBing1，ZhangJie2，Xu Jie2，et al
（1.Department ofHuman Parasitology，School ofBasic Medicine，XinjiangMedical University，Urumqi 830054，China；2.Class 2010-2，Clinical Medicine，XinjiangMedical University）

Cryptosporidium（Cryptosporidium SPP.）is a kind ofparasite that can cause infection in people,domestic animals and wildlife.Because the egg capsule is too small to be observed in identification under light microscopy conveniently,a lot of researches on the methods of cryptosporidium detection have been taken at home and abroad.In this paper,the main methods for detectingcryptosporidium and their advantages and disadvantages were reviewed.

Cryptosporidium；detection methods；progress

S851.2

A

2095-3887（2014）02-0056-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.018

2014-01-16

新疆维吾尔自治区青年科学基金（2012211B13）

张冰（1981-），女，讲师，硕士研究生。