G蛋白偶联受体对T型钙通道调节机制的研究进展

黄 沙，黄东阳，张海林

（河北医科大学药理学教研室，河北石家庄 050017）

T型钙通道又称低电压激活钙通道（LVA钙通道）是一种电压依赖型钙离子通道，其组织分布广泛，在调控神经放电、激素分泌、平滑肌收缩等生理过程中具有重要的作用［1］。1975年Hagiwara等［2］使用双电极电压钳的方法证实不同钙通道的存在，然而区分出多种钙通道是在1984～1985年，利用单通道膜片钳技术，人们直接地记录到了T型钙电流［3］，此类通道的单通道电导非常低，约为5～9 pS（110 mmol·L－1Ba2＋），因此又被称为小电导型电流。T型钙通道由于激活电压较低（＞－70 mV），失活速度较快，开放时间较短等特征，并对心脏的起搏、中枢及外周神经元的兴奋性等有重要影响，故一直是电生理研究领域的热点。T型钙通道家族目前有3个成员，即 Cav3.1（α1G）、Cav3.2（α1H）、Cav3.3（α1I）［4］。近年来，越来越多的证据表明，T型钙通道在机体生理和病理情况中都起着非常重要的作用，如睡眠、疼痛、癫痫、高血压、充血性心衰、癌症、帕金森病等［5－6］。T型钙通道在细胞中的分子调节机制尚不很明确，因此，阐明T型钙通道调节机制有重要意义。大量研究表明，G蛋白偶联受体（GPCRs）以及下游多种第二信使都对T型钙通道起到一定调节作用［4，7－8］。本文将重点针对近年来有关 GPCRs对 T型钙通道调节作用的研究进展进行综述。

GPCRs是一类具有7次跨膜结构的细胞表面受体，其细胞膜内侧部分与鸟苷酸结合蛋白（G蛋白）相偶联。当GPCRs被相应配体激活后，首先激活偶联的G蛋白，G蛋白作为一种转导体可以将细胞外的信号转化为细胞内信号，从而引起细胞内各种调节作用。G蛋白由α、β、γ3个亚基组成。根据 Gα亚基的不同，G蛋白被分为4个亚类（Gαs、Gαi／o、Gαq／11、Gα12／13）。目前已知哺乳类具有 20多种不同的Gα亚基，至少5种不同的 Gβ亚基和12种不同的Gγ亚基［9］。

近年来的研究发现，GPCRs对T型钙通道调节机制主要分为两大途径：一种是单独由G蛋白βγ亚基介导的调节；另一种是由激活GPCRs后，继而激活Gα亚基以及下游第二信使介导的调节。为方便比较，本文将对第2种途径按不同受体进行分类阐述。

1 G蛋白βγ亚基对T型钙通道的调节

为了研究G蛋白βγ亚基是否参与调节T型钙通道，2003年 Barrett实验室 Wolfe等［10］将 β2γ2和 β1γ2分别与α1H共表达于HEK293细胞中，发现β2γ2能够选择性抑制Cav3.2（α1H）电流。进一步研究表明 β2γ2的作用是由于β2γ2与 Cav3.2（α1H）通道蛋白Ⅱ －Ⅲ跨膜区胞内连接片段结合所导致。此区域被替换后，抑制作用就会消失；将此片段转接到 Cav3.1（α1G）通道结构中，发现 β2γ2也可以抑制Cav3.1（α1G）钙电流。因此，Ⅱ －Ⅲ连接片段是 β2γ2抑制Cav3.2电流的关键位点。

此研究结果与 Herlite等［11］发现的 G蛋白 βγ对 Cav2（N、P／Q型）高电压激活钙通道的抑制机制较为相似。但不同的是β2γ2对T型钙通道的抑制作用是非电压依赖型，而βγ对Cav2抑制是电压依赖型［10］。传统观点认为，G蛋白βγ亚基通过结合并改变通道的开放模式从而起到对Cav2的抑制作用，由于βγ与通道的结合具有电压依赖性，所以这种抑制作用也具有电压依赖性，并且此结论被大量实验所证实［11］。这就是人们很早提出的“willing-reluctant”门控模型［12］。针对这一不同，Wolfe等［10］也作出了相应解释，虽然β2γ2对Cav3.2通道的抑制作用是非电压依赖，但其并没有改变通道蛋白的细胞膜表面表达。

随后，同样是Barrett实验室，Hu等［13］的进一步研究发现，蛋白激酶A（PKA）能够调控G蛋白β2γx亚基对Cav3.2电流的非电压依赖性抑制作用，而且此抑制作用是通过1 107位的丝氨酸磷酸化实现的，而1 107位丝氨酸残基是通道孔蛋白Ⅱ－Ⅲ连接片段的关键位点。

2 多种G蛋白偶联受体对T型钙通道的调节

研究表明，在背根神经节（DRG）、心肌等原代细胞中，激活GPCRs（如NK1受体、阿片受体、多巴胺受体等）都对T型钙电流有调节作用，并且此过程涉及细胞内多种第二信使［4，7］。然而，由于这些细胞中T型钙通道亚型不同、G蛋白不同、GPCRs不同，加之实验条件不同，使得这些研究结果之间存在许多矛盾之处。然而近年来，将编码单一T型钙通道亚型和单一GPCR的cDNA共表达于异源细胞系（如HEK293细胞等），成为研究T型钙通道调节机制一种很好的方法［14］。因此，本文将把原代细胞和表达系统的研究结果结合起来讨论，以便更好地理解GPCRs对T型钙通道复杂的调节机制。

2.1 NK 1受体 NK1受体属于GPCRs的一员，可被速激肽P物质和神经激肽A（NKA）激活。NK1受体主要与Gq／11家族偶联，能激活典型的 PLCβ、PIP2、DAG、PKC信号通路［15］。

早期研究发现，在大鼠脊髓侧角神经元中，P物质可以增大镍敏感的T型钙电流。然而，在大鼠基底核神经元上，镍敏感的T型钙电流被P物质抑制。除此之外，在蟾蜍胃平滑肌细胞上，P物质可以增大L型钙电流，但是对T型钙电流无作用。

2010年，Rangel等［15］将 Cav3.2和 NK1受体共表于HEK293细胞中，研究发现NK1受体激动剂NKA可抑制Cav3.2电流。应用Gq／11抑制剂RGS2和RGS3T，可阻断此抑制作用；分别使用PLCβ和PKC的选择性抑制剂U73122、bisindolylmaleimide I，亦可以阻断此抑制作用。由此得出，通过Gq／11偶联的 NK1受体，经PKC信号通路能够抑制重组Cav3.2通道电流。

2.2 毒蕈碱受体 毒蕈碱受体简称M型受体，可分为5种亚型（M1～M5）。

早期研究发现，在大鼠CA1海马中间神经元以及过表达M3和M5受体的3T3成纤维细胞（NIH3T3）中，M受体激动剂乙酰胆碱可以增加T型钙电流；在大鼠DRG细胞中，乙酰胆碱却抑制T型钙电流；在大鼠胆碱能基底前脑神经元大细胞中，乙酰胆碱对T型钙电流无作用。

2007年，Hildebrand等［16］将 M1受体与 Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3分别共表于HEK293H细胞中，利用打孔膜片钳记录方式，发现激活M1受体能够很大程度地选择性抑制Cav3.3电流，而对 Cav3.1、Cav3.2没有作用或产生小幅度的增大作用。研究还发现M1受体对Cav3.3电流的抑制作用是通过Gq／11，且激活Gq／11偶联的M3和M5受体也能够抑制Cav3.3电流，但激活Gi偶联的M2和M4受体无此作用。2011年，Zhang等［17］在小鼠DRG小神经元中发现，激活M3受体能够抑制T型钙电流。在内液中加入GDP-β-S或预孵育PTX，能够完全阻断此抑制作用。当使用去极化前刺激时，此抑制作用仍然存在，表明激活M3受体所引起的T型钙电流的抑制并不是因为G蛋白βγ亚基与T通道的直接结合。进一步实验结果表明，使用白屈菜赤碱和新型PKC阻断剂GF109203X能够阻断此抑制作用。然而，应用经典的PKC阻断剂Ro31-8820或抑制PKA，并不能阻断此抑制作用。因此，作者总结得出：M3受体介导的T型钙电流的抑制是通过PTX敏感的新型PKC途径。

2.3 促肾上腺皮质素释放因子受体 促肾上腺皮质素释放因子（CRF）是机体重要的神经调节因子，其信号的传导也是通过G蛋白偶联受体，包括CRFR1和CRFR2。

2007年Kim等［18］的研究发现，在MN9D多巴胺能细胞中，激活CRFR能够抑制T型钙电流。应用CRFR1特异性阻断剂，此抑制作用消失。并且，这种抑制作用可被PKC激动剂所模拟，以及被PKC抑制剂所阻断。这些结果表明，在MN9D细胞中，CRFR1对T型钙电流的抑制作用是通过激活PKC信号途径介导的。然而，2008年Tao等［19］在表达系统HEK293细胞中的研究结果却与之不同，他们将CRFR1与Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3分别共表于 HEK293细胞中，激活CRFR1能够选择性抑制Cav3.2电流，而对 Cav3.1和Cav3.3电流无作用。并且此抑制作用并不依赖PLC、酪氨酸激酶、PKC以及其他激酶途径，而是依赖于霍乱毒素敏感的G蛋白的βγ亚基。这些结果表明，CRFR1对T型钙通道的调节高度依赖细胞内环境。

2.4 阿片受体 体内至少存在8种阿片受体亚型，而中枢神经系统内至少存在4种亚型（μ、κ、δ和σ）。现广泛认为，此 4种阿片受体都与 Gαi／o偶联［20］。

1991年在大鼠DRG神经元上，Schroeder等［21］发现选择性μ受体激动剂DAMGO可以抑制T型钙电流。然而，2004年Wu等［22］研究发现，在大鼠小直径DRG神经元中，DAMGO对T型钙电流（＞100 pA）无作用，但可以抑制高电压激活的钙电流（HVA钙电流）。对于这种矛盾现象，Wu等［23］的进一步研究结果对此作了合理的解释。他们研究了T型钙通道蛋白和μ型阿片受体两者在大鼠DRG中表达的关系。RT-PCR结果表明，μ受体mRNA仅存在于缺乏明显T型钙电流的DRG神经元中，即有明显T型钙电流的DRG神经元不表达μ受体。

2.5 多巴胺受体 多巴胺受体根据生化和药理学性质，可分为D1类和D2类受体。其中，D1类受体包括D1、D5，与Gαs偶联；D2类受体包括 D2、D3、D4，与 Gαi／o偶联［24］。

早期，人们就分别在小鸡感觉神经元、肾上腺肾小球区细胞等原代细胞中发现多巴胺可以抑制镍敏感的T型钙电流。1997年Drolet等［25］在肾上腺肾小球区细胞上，发现D1受体介导的T型钙电流的抑制是需要Gβγ和cAMP的联合作用。此结果现已被Hu等［13］的研究进一步证实，一方面，蛋白激酶A（PKA）能够调控 β2γx亚基对 Cav3.2电流非电压依赖型抑制；另一方面，D1和D2受体在调控Cav3.2通道过程中存在协作作用。将Cav3.2表达到H295R细胞中（该细胞本身表达有内源性多巴胺受体，但不表达Cav3.2通道），根据抑制后电流特性的相似变化，证实多巴胺确实在H295R细胞中模拟了HEK293细胞中β2γ2对Cav3.2电流的非电压依赖型抑制。为了进一步探索多巴胺受体介导Cav3.2电流的抑制是否需要cAMP和活性Gβγ，分别加入了Gβγ消除蛋白transducin、βARKct或PKA选择性抑制剂PKI，结果发现多巴胺对Cav3.2电流的抑制作用被消除了。接着，又尝试单独使用D1或D2受体选择性激动剂，发现并不能抑制Cav3.2电流，而当联合应用时就能够抑制Cav3.2电流。所以，Hu等［13］提出，多巴胺调控 Cav3.2电流是双重受体调节机制，即：多巴胺引起的Cav3.2电流非电压依赖性抑制作用需要活性Gβγ和PKA共同介导。

除上述几种G蛋白偶联受体以外，还有GABAB受体和神经介素受体等其他GPCRs对T型钙通道的调节。但庞大的GPCRs的数量也增加了研究的难度 。因此，虽然人们针对GPCRs对T型钙通道的研究并不少，但其调节机制的复杂，至今仍然并不清晰。

3 结语

T型钙通道在生理和病理情况下都有着重要作用，大量神经递质和激素都通过G蛋白偶联受体而对其起到调节作用，因此阐明G蛋白偶联受体对T型钙通道的调节机制显得越发重要。回顾以往的研究，我们能够发现，GPCRs对T型钙通道的调节并不是上述两种途径的单独作用，而是由两种途径共同作用，即：我们不能简单地认为其仅仅是通过βγ亚基的抑制，而没有第二信使的参与，反之亦然。因此，实际情况似乎看起来并不像原来预期的那样简单。然而，随着各个偶联受体和通道亚型在表达系统的建立以及有关T型钙通道其他方面的研究进展，如基因敲除动物的产生、特异性阻断剂的研发等，相信此科学问题将会获得更好的解答。

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