魏氏梭菌α毒素分子生物学研究进展

1 α毒素的生物学特性

魏氏梭菌广泛分布于土壤、水、食物、人畜肠道中，侵入患者伤口后，由于受损部位缺血造成缺氧，组织氧化电势(Eh)下降，使其得以生长繁殖;同时往往与需氧菌混合感染，消耗组织内氧气，使Eh进一步降低，而细菌本身分解糖类产生的大量气体压迫血管，更加重组织的缺血缺氧，诸多因素均造成组织内低Eh环境，更利于该菌的生长繁殖，产生大量的α毒素［5－6］。α毒素具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性［7－8］。α 毒素分子量约为43 kDa，通过比对 α毒素基因和磷脂酶 C(Phospholipase C，PLC)基因的核苷酸序列，结果表明α毒素与这种酶N端大约250个残基有很强的同源性［9－10］。此外α毒素的C末端还有一个120个残基的额外结构域。这些发现说明α毒素属于PLC家族［11－12］。由于α毒素能水解卵磷脂的C链，产生磷酰胆碱和甘油二脂，故又称为PLC。对α毒素进行的晶体分析显示，它的结构可以分成两个区域:N端区域，有9个紧紧压缩的α螺旋;C端结构域包含8个反平行的β折叠层。N端含有3个包含锌离子的活性位点。而且含有锌离子的氨基酸残基对酶的活性十分重要。混合α毒素C端和N端可恢复其溶血活性，表明C端影响着N端的活性［13］。研究表明，C端结构域的折叠与突触结合蛋白等真核磷脂结合蛋白的“C2”结构域及其类似结构相似。在信号转导中发挥重要作用的真核蛋白也包含类似结构域;269位和336位的天冬氨酸与钙离子的特异性相互作用有关［14－15］。此外，275位、307 位和 331位的酪氨酸对α毒素的结合起关键作用。C端结构域可能在与细胞膜的结合中扮演重要角色［16］。

α毒素可裂解由磷脂酰胆碱(PC)或鞘磷脂(SM)组成的脂质体，从而使羧基荧光素(CF)和磷酸胆碱释放出来。随着脂质体相变温度的升高，羧基荧光素(CF)释放减少，这表明，脂质体对α毒素的敏感性与相变温度有很大的关系［17］。而且α毒素结合脂质体和α毒素导致的脂质体中的磷脂酰胆碱(PC)的水解都与脂质体中磷脂酰胆碱(PC)的相变温度有关。由此可见，α毒素对膜的裂解作用同脂质体的流动性息息相关。6－丙烯酰－2－二甲基氨基萘标记的C端结构域与脂质体结合并出现显著的蓝色偏移。这表明C端结构域插入到脂质体中的疏水区，也说明α毒素对生物膜的破坏作用依赖于膜的流动性，而且这种破坏作用依赖于C端结构域插入到膜脂双分子层中。

2 α毒素基因的克隆和分析

α毒素的编码基因位于染色体上的复制起始区并且毗连rrnA基因。该区域是细菌染色体上最稳定的区域之一。α毒素基因首次从产生高水平α毒素的A型魏氏梭菌中被克隆并测定了其核苷酸序列［18－19］。α毒素基因已经在大肠杆菌中实现了高效表达，在卵黄琼脂培养基上其菌落周围产生了浑浊区域，而在含有红细胞的琼脂培养基上产生了溶血效应。核苷酸测序表明其含有一个包括原核信号序列的开放阅读框。大肠杆菌中表达的α毒素蓄积在周质空间也表明这一信号序列的存在。另外在魏氏梭菌的培养上清液中纯化出了α毒素蛋白进一步证实了上述观点［20］。随后从魏氏梭菌其他菌株里也克隆出α毒素基因并揭示了其生物学特征。这些α毒素基因都位于染色体上的复制起始区，并且平均有1.3%的核苷酸序列不同。

3 α毒素对细胞和生物膜的作用

高浓度的α毒素可大量水解生物膜上磷脂酰胆碱和鞘磷脂。然而，低浓度的α毒素只能少量水解磷脂酰胆碱和鞘磷脂并且产生二酰甘油和神经酰胺。这些反应会激活多种信号传递途径。从而产生多种胞间介质。α毒素也可激活生物膜上的磷脂代谢导致鼠肠和动脉组织的痉挛［21－22］。而且α毒素还可激活小鼠主动脉中花生四烯酸的级联反应［23］。研究表明α毒素引起的痉挛与花生四烯酸变成血栓素A2有很大关系。最近又有报道称，其他微生物产生磷脂酶 C也有类似现象［24］。因此，很可能细菌中的磷脂酶C模拟真核生物细胞膜中磷脂酶C的作用。

α毒素可诱导产生细胞胞间介质、细胞间黏附分子1(ICAM－1)、白介素－8(IL－8)，肿瘤坏死因子－α(TNF－α)，血小板活化因子(PAF)和内皮细胞白细胞黏附因子(LECAM)［25］。这些胞间因子的产生进一步增加了血管的渗透性和水肿［26］。α毒素使血小板纤维蛋白原受体发生了易位，使其从血小板内部转到外膜，同时使血小板发生了凝集［27－28］。此外，在 α 毒素、肿瘤坏死因子－α(TNF－α)和干扰素－γ(IFN－γ)分别作用下，细胞发生了相类似的形态学改变［25］。

4 α毒素的表达调控

早期从气性坏疽病人体内分离到的魏氏梭菌产生的α毒素水平比较低，所以并不能阐明α毒素在疾病中扮演的角色。α毒素表达差异主要是由于α毒素基因的转录调控［29－30］。虽然α毒素在体内的表达可能是被正调控的，但是有必要揭示出α毒素基因的调控机制。指导α毒素基因转录的启动子包括－10和－35保守区，位于SD序列的上游。虽然α毒素基因的调控位点还没有被鉴定出来，但是位于－35保守区上游的多个重复A碱基对于α毒素基因表达起着关键作［31－32］。和其他致病菌一样，魏氏梭菌通过VirR/VirS双组分调控系统来调控基因的表达［33－34］。VirS作为组氨酸激酶传感器，对环境信号做出应答，从而磷酸化VirR，磷酸化的VirR调控靶基因的转录。对于调控VirR/VirS功能环境因素的鉴别不但能使我们充分理解细菌在伤口中上调α毒素的水平，而且也能更好地解释在健康人肠道中α毒素表达被下调，而在某些疾病条件下被上调的原因。

5 α毒素与疾病

魏氏梭菌是人和动物多种疾病主要的致病因子。A型魏氏梭菌可引起伤口气性坏疽。气性坏疽是一种严重的创伤感染性疾病，多见于软组织严重开放性损伤。另外少数肠道手术后由于肠内容物的污染也可以引起气性坏疽［35］。但并不是所有伤口感染了魏氏梭菌都会引起气性坏疽。气性坏疽病的发生，并不单纯地取决于魏氏梭菌的存在，更决定于人体抵抗力和伤口的情况，即需要一个有利于魏氏梭菌生长繁殖的缺氧环境。因此，失水、失血或休克，而又有伤口的大片组织坏死、深层肌肉损毁，容易发生气性坏疽病。

实验证明气性坏疽主要是由魏氏梭菌产生的α毒素引起的。首先灭活α毒素基因的魏氏梭菌突变株在气性坏疽的鼠模型中大大减少。其次用α类毒素免疫的小鼠可以有效抵抗气性坏疽病。α毒素感染创伤面以后，破坏局部组织和炎症细胞;当毒素浸润至周围组织或进入全身循环系统后，可引起中性粒细胞和内皮细胞间黏附作用的调节异常并上调白细胞的呼吸爆发，导致血管内白细胞淤滞、内皮细胞受损和局部组织缺氧。组织的灌注不足有利于厌氧菌的生长，使气性坏疽的病变范围迅速扩大。此外，α毒素还可引起严重的溶血和组织坏死。休克的发生与毒素的直接和间接作用有关。在体外试验中，α毒素可直接抑制心肌的收缩力，可因心输出量的急剧减少而造成低血压。

6 展望

虽然已经揭示了α毒素在气性坏疽中的作用机理，但在人和动物非坏疽性疾病中的作用机制并没有被完全阐明。动物中许多疾病的发生都与α毒素息息相关，尤其是α毒素能降低饲料中抗生素的水平。目前急需揭示α毒素在这些疾病中的作用机理，同时评价α毒素疫苗在预防这些疾病中的效果。为了支持这些研究，有必要阐明α毒素基因的调控机制，进一步了解环境因素刺激能否上调肠道和宿主组织中α毒素的产量，对于α毒素毒力分子基础的了解，使我们能够解释α毒素和细胞膜相互作用的机制。然而仍旧有许多问题需要做进一步的研究，比如底物特异性的分子基础是什么，细胞膜是怎样把磷脂填充到活性位点的，这些问题的解答有助于α毒素抑制剂在临床上的应用，尤其希望能开发出利用α毒素的抗肿瘤药物。

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