2型糖尿病鼠类模型的研究进展

高秀莹，周迎生

(首都医科大学附属北京安贞医院内分泌代谢科，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

糖尿病已成为全球性的公共健康问题，据IDF统计2013年全球糖尿病患者达3.82 亿，预计至2035年全球糖尿病患者将增至5.92 亿［1］。在我国，糖尿病成为继肿瘤、心脑血管病之后的第三大严重危害人们健康的慢性疾病，2010年我国糖尿病患者已达9240 万［2］，其中超过90%的患者为2 型糖尿病。2 型糖尿病的发病机制尚未明确，建立一种既符合人类2 型糖尿病发病特点，又稳定、实用的动物模型在2 型糖尿病研究中起着至关重要的作用。鼠类作为目前应用最广的糖尿病动物模型，因其体积小、生长周期短、经济易得、易于实现基因修饰等，较其他种属有着无可比拟的优势。目前2 型糖尿病鼠类模型主要分为三大类:自发性2 型糖尿病模型、诱发性2 型糖尿病模型、转基因/基因敲除2 型糖尿病模型。本文对近年来国内外较常用的2 型糖尿病鼠类模型构建、主要疾病特征、确立标准及其应用进行概述，为研究者提供参考。

1 2型糖尿病鼠类模型分类

1.1 自发性2 型糖尿病模型

该模型动物未经过任何有意识的人工处置，多数采用有自发性糖尿病倾向的近交系纯种动物，按照饲养条件喂养，自发成模，最接近人类疾病的发病过程。该模型可分为肥胖自发性2 型糖尿病模型和非肥胖自发性2 型糖尿病模型，因2 型糖尿病患者多伴肥胖，故以前者应用居多。

1.1.1 肥胖自发性2 型糖尿病模型

常用的肥胖自发性糖尿病模型包括单基因遗传背景的ob/ob 小鼠、db/db 小鼠、Zucker 糖尿病肥胖大鼠(Zucker diabetic fatty rat，ZDF)和多基因背景的KK/Ay 小鼠、OLETF 大鼠。

ob/ob 小鼠和db/db 小鼠非常接近人类糖尿病特征，它们分别是瘦素基因突变和瘦素受体突变引起。ob/ob 小鼠(C57BL/6J 背景)，断奶时即开始发胖，终生食欲旺盛，11 周龄体重可达野生小鼠的2倍［3］;3 ～4 周龄出现高胰岛素血症、胰岛素抵抗、轻度高血糖，最近研究表明ob/ob 小鼠11 周龄即可出现糖尿病周围神经病变［3］。与db/db 小鼠不同的是，该鼠肥胖及胰岛素抵抗较重(15 周龄ob/ob 小鼠vs. db/db 小鼠，54.5±2.3g vs. 40.7±1.1 g)，而血糖仅轻度升高，非空腹血糖一般不超过20 mmol/L，且胰岛形态较大(15 周龄ob/ob 小鼠vs.db/db 小鼠，86±76 μm vs. 47±24 μm)［4］。db/db小鼠(C57BL/6J 背景)在2 周龄出现高胰岛素血症，8 周龄血清胰岛素水平可达野生小鼠的15 倍;3～4 周龄明显肥胖，8 周龄体重可达野生小鼠的2倍;4 ～6 周龄血糖开始升高，8 周龄随机血糖可高达30 mmol/L，空腹16 h 血糖约16 mmol/L，8 周龄病理切片显示胰岛β 面积增加50% ～80%［5，6］，同时伴高胆固醇血症和高甘油三酯血症，4 ～6月血胰岛素水平降低，表现为严重的胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足，与人类2 型糖尿病发病进程类似。db/db小鼠不仅有典型的糖尿病临床表现，也表现出心肌病、周围神经病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、伤口愈合迟滞等糖尿病并发症。ZDF 大鼠是从出现糖尿病表型的Zucker(fa/fa)大鼠中筛选出来的，存在瘦素受体突变，是典型的高胰岛素血症肥胖模型，伴高甘油三酯和高胆固醇血症，血游离脂肪酸升高。雄性6 ～8 周龄，雌性9 ～11 周龄时因β 细胞凋亡增加不能代偿胰岛素抵抗即发展为糖尿病，非空腹血糖约在20 mmol/L;6 周龄血浆胰岛素升高，8 周龄达对照小鼠3 倍，8 周龄后随着β 细胞功能进行性下降血浆胰岛素水平进行性下降［7，8］，14 周龄时出现胰岛素缺乏。ZDF 大鼠常用于研究2 型糖尿病中胰岛素抵抗和β 细胞功能损伤关系的机制。

KK/Ay 小鼠是KK 小鼠编码调节皮毛颜色的Agouti 基因突变而培育的一种自发性2 型糖尿病模型。研究报道［9，10］KK/Ay 小鼠6 周龄体重即明显高于对照组，18 周龄雄性小鼠体重最高达(51.21±1.93)g;6 周龄血浆胰岛素升高，为对照小鼠的9.7倍并一直维持在较高水平;10 周龄时血糖升高≥13.9 mmol/L，该鼠血糖最高值平均在22.8 mmol/L左右并稳定维持于该水平。KK/Ay 小鼠肾脏损害与人类糖尿病肾病非常相似，是目前国际上广为采用的研究2 型糖尿病肾病早期病变的良好动物模型。OLETF (Otsuka Long Evans Tokushima Fatty)大鼠是日本Otsuka 制药公司建立的纯系，其胆囊收缩素1 受体缺失，饱腹感信号反馈丢失是导致摄食过量和肥胖的原因。早期以肥胖、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱为主，β 细胞功能与同系正常LETO 大鼠无显著差异，与KK/Ay 小鼠显示的重度肥胖不同，它表现为轻度肥胖，15 周龄时体重比对照小鼠增加11.4%［11］，在18 ～25 周龄缓慢进展为糖尿病，特点为自发性高血糖伴多食、肥胖、胰岛素抵抗，高胰岛素血症、高甘油三酯、高胆固醇血症，并出现蛋白尿，40 周龄后胰岛素分泌功能降低，到晚期合并糖尿病肾病［11］，与人类2 型糖尿病病程极为相似。胰岛病理及超微结构显示20 周龄胰岛增生，β 细胞内可见高度扩张肥大的高尔基体和内质网，但β 细胞内成熟的分泌颗粒减少，可见较多空泡［12］，尽管此时胰岛素代偿性高分泌，但胰岛素质量不佳也是其发展为糖尿病的原因。OLETF 大鼠提供了一种新的不依赖瘦素信号通路的肥胖模型，广泛应用于2 型糖尿病及糖尿病肾病研究。

1.1.2 非肥胖自发性2 型糖尿病模型

GK 大鼠(Goto－Kakizaki)是典型的多基因非肥胖自发性2 型糖尿病模型，特征是体重增长缓慢明显低于对照组，血糖轻中度升高，以负荷后高血糖为主，空腹血糖可长时间不高或仅轻度升高，随机血糖在15 ～23 mmol/L 之间且在相当长时间内(18 个月)稳定在该水平，伴胰岛素抵抗、胰岛素分泌受损，血脂轻度升高。初生GK 大鼠由于β 细胞增殖缺陷和异常凋亡导致成年GK 大鼠胰岛β 细胞量下降60%，胰岛形态学改变表现为胰岛结构紊乱，β细胞细胞核形状欠规则，核仁消失，染色质边集，核周间隙扩张，无明显线粒体肿胀，呈凋亡早期改变［13］。该鼠从出生到断乳(3 ～4 周龄)血糖正常，可作为糖尿病前期模型研究，其后随机血糖升高、糖耐量减低，14 周龄时葡萄糖刺激的胰岛素分泌显著下降，为正常Wistar 大鼠的25% ～50%。该鼠晚期可出现糖尿病各种并发症，且不受肥胖、高血压等其他因素的干扰，一定程度上可模拟临床2 型糖尿病患者的病理生理改变，故GK 大鼠是研究糖尿病并发症(如肾病、视网膜病、周围神经病变、大血管病变)非常有用的模型，尽管该模型早期β 细胞破坏与2 型糖尿病发病机制不甚相同。GK 大鼠还常用于研究胰岛β 细胞数量与2 型糖尿病发生的关系。

1.2 诱发性2 型糖尿病模型

诱发性2 型糖尿病模型是通过物理、化学等致病因素人工诱发出具有2 型糖尿病特征的动物模型。制备方法主要包括手术诱导、化学药物诱导和饮食诱导。其中手术诱导(胰部分切除术)因操作复杂、诱导时间长、无法控制切除后胰岛的再生已很少应用。目前国内外最常用的为化学药物联合高能量饮食诱导。

1.2.1 单纯高脂或高糖饮食诱导的2 型糖尿病模型

单纯给实验动物饲喂高脂高糖饲料，能够诱发肥胖、高脂血症、高胰岛素血症、糖耐量减低等胰岛素抵抗的特征。高脂饮食一般选用脂肪供能占总能量的40% ～60%的高脂饲料，动物喂养高脂饲料的起始年龄最好在6 ～8 周龄，此周龄动物生长代谢旺盛能最有效的诱导肥胖。高糖饮食一般选用果糖或蔗糖，以果糖居多，一般选用60% ～65%高果糖饮食或10%的果糖饮水喂养2 ～16 周［14，15］。与葡萄糖不同的是，果糖不能刺激胰岛素分泌，但却能促进肝脂质从头合成。高果糖摄入可诱导啮齿类动物出现代谢综合征的一些组分包括高血压、胰岛素抵抗、糖耐量减低、血脂紊乱［16］，但需较长时间才能诱导肥胖及空腹血糖升高。蔗糖作为食物中果糖的主要来源，作用与果糖类似。

饮食诱导模型常选用的鼠类动物为沙鼠(Psammomys obesus，P．obesus)、C57BL/6J 小鼠及大鼠。沙鼠是重要的饮食诱导的肥胖和2 型糖尿病模型，沙鼠在自然环境下不发生肥胖和糖尿病，若给予高能饮食即发展为中度肥胖和高血糖，与其他鼠类模型不同的是，沙鼠饮食诱导的糖尿病发病和进展非常迅速，给予高能饲料1 周，沙鼠出现高胰岛素血症，清晨随机血糖达15mmol/L［17］，胰岛β 细胞体积减为原来的1/3，予高能饮食22d 后出现空腹高血糖，β 细胞量降低，4 ～6 周即出现β 细胞量显著降低，达β 细胞功能衰竭、胰岛素分泌缺失的终末期［18］。沙鼠常被用于药物干预治疗2 型糖尿病的模型。C57BL/6J 也是常用的饮食诱导肥胖模型，尽管有报道给予高脂饮食4 周足以诱导胰岛素抵抗［19，2］，但由于β 细胞的代偿增生，可长期空腹血糖正常，诱导空腹高血糖往往需要较长的诱导时间(＞16 周)。Mizutani 等［21］给予9 周龄雄性C57BL/6J 小鼠高脂饲料(脂肪含量32%，High－fat Diet 32，CLEA Japan)18 周出现糖尿病(空腹血糖10.6±0.6 mmol/L)。另一项研究［22］以脂肪热量比为45%的高脂饲料(Research Diet D12451)喂养5 周龄雄性C57BL/6J 小鼠，12 周时空腹血糖较对照组仍无差异。SD (Sprague－Dawley)大鼠较其他品系的大鼠对高脂饲料非常敏感，也常用作饮食诱导的肥胖糖尿病模型，但仍需较长的诱导时间(＞10 周)才能诱导出2 型糖尿病的主要表型特别是空腹高血糖。Wu 等［23］给予雄性SD 大鼠高果糖饲料(果糖含量66%，Teklad)12 周，出现空腹血糖较对照组升高(6.0±0.5 mmol/L vs. 5.4±0.3 mmol/L)、高胰岛素血症、高脂血症及高血压，但尚未达糖尿病标准。张贝等［24］以脂肪热量比为55%高脂饲料喂养8 周龄雄性Wistar 大鼠23 周，出现内脏肥胖、胰岛素抵抗、血甘油三酯及游离脂肪酸升高，但实验结束时空腹血糖仍无差异。

1.2.2 高脂或高糖饮食+STZ 诱导的2 型糖尿病模型

如上所述，由于单纯高脂高糖饮食诱导2 型糖尿病耗时较长，限制了其在研究中的应用。目前应用最广泛的是高热量饮食+化学药物诱发的2 型糖尿病模型。该方法通过高糖高脂饮食诱导动物胰岛素抵抗后，再注射低剂量STZ 部分损伤胰岛β 细胞，引起血糖升高，模拟2 型糖尿病的发病过程并大大缩短了建模的周期。该模型特征为胰岛素抵抗、中度高血糖、高血脂、血浆胰岛素水平多正常［25］。化学药物常用链脲佐菌素(STZ)，STZ 是氨基葡萄糖的亚硝脲衍生物，可以选择性破坏胰岛β 细胞，诱导动物产生糖尿病，β 细胞损伤的程度取决于STZ 的剂量。以往曾采用大鼠单次大剂量腹腔注射STZ (＞60 mg/kg)造模，病理显示胰岛β 细胞大量破坏，发病机制上更接近1 型糖尿病，现已较少应用。造模常用的动物为大鼠或小鼠，以大鼠为多，且雄性大鼠比雌性大鼠对STZ 更敏感。关于大、小鼠常用的STZ 剂量尚无统一标准，文献报道不一，大鼠常用35 ～65 mg/kg，小鼠常用100 ～200 mg/kg 腹腔注射［19，26］。

Srinivasan 等［27］以脂肪热量比为58%的高脂饲料喂养雄性SD 大鼠(160 ～180 g)2 周，然后以STZ(35 mg/kg)腹腔注射，以非空腹血糖≥16.7 mmol/L 诊断糖尿病，模型组表现为肥胖、胰岛素抵抗、高血糖(非空腹血糖23.2±0.5 mmol/L)、高血脂、血胰岛素正常，并且该模型对2 种降糖药吡格列酮和格列吡嗪也很敏感，进一步证实了短期高脂喂养联合低剂量STZ 注射制作2 型糖尿病模型的可行性和适用性。Ti 等［20］以脂肪含量34.5%的高脂饲料(北京华阜康生物科技有限公司)喂养雄性SD 大鼠(120 ～140 g)4 周，其后以STZ(27.5 mg/kg)腹腔注射，1 周后测空腹血糖＞11.1 mmol/L 入选模型组，模型组表现为多食、多饮、多尿，伴肥胖、胰岛素抵抗、中度高血糖(空腹血糖15 ～20 mmol/L)、高血脂，并在糖尿病后6 ～12 周出现糖尿病心肌病。Li等［28］采用7 周龄雄性SD 大鼠，予高脂高糖饮食(10%猪油，20%蔗糖，2%胆固醇，1%胆盐，北京科澳协力饲料有限公司)喂养8 周后，禁食12 h 以STZ 45 mg/kg 腹腔注射，3 周后测空腹血糖＞16.7 mmol/L 作为建模成功的标准来研究艾塞那肽的药代动力学。本课题组曾采用4 周龄雄性SD 大鼠以高脂高糖饲料(20%的脂肪，20%蔗糖)喂养4 周后，一次性腹腔注射低剂量STZ 40 mg/kg 建立2 型糖尿病模型，具有肥胖、高血糖、血脂异常、胰岛素抵抗等基本特征，免疫组化显示胰岛内胰岛素含量下降但仍维持在一定的水平，与人类初发2 型糖尿病时β 细胞数量下降50%相符合，从而模拟了2 型糖尿病的病理生理过程［29］。

还有一种非肥胖诱发性2 型糖尿病模型，即STZ－烟酰胺模型，该模型模拟非肥胖的2 型糖尿病患者(多见于亚洲人群)。Masiello 等［30］对10 周龄雄性Wistar 大鼠在应用65 mg/kg STZ 前15 分钟，先予烟酰胺(230 mg/kg)腹腔注射，烟酰胺能部分保护β 细胞功能，避免STZ 对β 细胞过多的损伤，使动物产生轻度稳定的非空腹高血糖(8.6±0.2 mmol/L vs. 6.7±0.2 mmol/L)而没有血浆胰岛素的改变，并保留了40%的胰岛素储备。

1.3 转基因/基因敲除2 型糖尿病模型

2 型糖尿病被认为是多基因异常疾病，不同组基因分子水平的缺陷可导致该病不同的病理生理改变。目前已开发出多种转基因/基因敲除模型，其中基因敲除法多用，实验动物多为小鼠。主要涉及以下相关基因位点［31］:胰岛素抵抗相关的IRS－1(胰岛素受体底物－1)、IRS－2、GLUT－4(葡萄糖转运蛋白－4)，糖脂代谢相关的PPARs(过氧化酶体增殖物激活受体)，以及胰岛素分泌相关的GLUT－2、GK(葡萄糖激酶)、IGF－1R(胰岛素样生长因子1 受体)。常见的模型有IRS－2－/－基因敲除小鼠、GK+/－IRS－1+/－双基因敲除小鼠、IR+/－IRS－1+/－双基因敲除杂合小鼠等。此外，新开发的组织特异性的基因敲除模型可分析某一基因在不同组织中的作用，如β 细胞、肝、脑等特异性的胰岛素受体基因敲除模型。近几年出现的hIAPP(人类胰岛淀粉样多肽)转基因大鼠作为新的2 型糖尿病模型可用于糖尿病发病机制及降糖药物研究［32］。

2 2型糖尿病鼠类模型确立的标准

鼠类模型2 型糖尿病的确立通过血糖来诊断，多采用鼠尾采血、血糖仪测定血糖值。首先，鼠类血糖正常值是多少呢?有报道正常大鼠的空腹血糖在5 ～8 mmol/L［33］，还有报道称高于人的空腹血糖值［34］。实际上，目前国际并无统一的标准，大多文献均是把对照鼠血糖值等同于正常血糖值。其次，关于糖尿病成模的血糖标准，各文献报道不一。大多数文献以空腹血糖值作为标准，空腹血糖标准在7.0 ～16.7 mmol/L 之间均有报道，以空腹血糖11.1 mmol/L 作为标准者居多。这种差异可能由以下两种原因造成:一方面可能由于种属差异所致;另一方面，测空腹血糖时禁食的时间不一，禁食6 ～12 h或过夜不等［20，28，35，36］也是造成上述差异的非常重要的原因。除了空腹血糖，亦有文献［37］以OGTT糖负荷后血糖作为鼠类糖尿病标准，如OLETF 大鼠以OGTT 后血糖峰值＞16.7 mmol/L 且120 min 血糖＞11.1 mmol/L 诊断糖尿病，符合两者之一诊断为糖耐量减低(IGT)。还有较少文献［21，27］以随机血糖≥16.7 mmol/L 作为鼠类糖尿病标准。此外，也有文献采用人类2 型糖尿病诊断标准(空腹血糖≥7.0 mmol/L 或OGTT 2h 血糖≥11.1 mmol/L 或随机血糖≥11.1 mmol/L)作为鼠类2 型糖尿病成模标准［38］。关于2 型糖尿病鼠类模型确立的标准仍有待规范和统一。

3 各种2 型糖尿病鼠类模型优缺点及如何选择

综上所述，由于2 型糖尿病是多基因与环境共同作用的复杂疾病，目前尚没有任何2 型糖尿病模型能够包括所有的人类疾病特征。理想的2 型糖尿病动物模型应尽可能模拟人类2 型糖尿病的自然病程，在疾病表现、胰岛素分泌功能及病理形态学方面应尽可能贴近人类，并涵盖胰岛素抵抗和胰岛β 细胞功能紊乱这两个最主要的病理特征。以上各种2型糖尿病鼠类模型各有其优缺点。

自发性糖尿病模型的优点为:病程发展特点与人类2 型糖尿病类似，具有同质的遗传背景，能控制环境因素，个体差异性较小，是2 型糖尿病病理、病因研究最理想的动物模型。但由于其频繁的近亲繁殖和单基因遗传与人类有所差异，及来源相对较少，饲养、繁殖条件要求严格，加之价格昂贵等因素，国内尚未普及。有些模型如GK 大鼠在国外应用较多，但由于很难获得，引入我国时间短，国内应用较少。

诱发性糖尿病模型，与人类肥胖引起的糖尿病发病机制相似。尤其高热量饮食+低剂量STZ 造模方法具有实验周期短、方法简便、相对可靠稳定、造模成本低等优点而成为国内最常用的2 型糖尿病建模方法。但这种造模方式也有其缺陷，即动物对诱导剂的反应不尽相同，会导致个体间有一定的差异，并且STZ 对其他组织也有一定的毒性。故应在保证成模率的前提下，把握好STZ 的剂量。需注意的是因采用的动物品系、起始周龄、高热量饮食中脂肪的构成比及含量、高脂高糖喂养时间、STZ 的剂量等不同，可导致动物成模的时间及成模后稳定性存在较大差别。理论上高脂高糖喂养的时间越长，所需STZ 剂量越小，但考虑到后续试验周期，也不应过于延长高脂喂养时间。文献报道高脂高糖喂养多在2 ～8 周之间，以4 周居多，因高脂4 周足够诱导胰岛素抵抗，并保证STZ 的剂量不至于过大。

转基因/基因敲除糖尿病模型的优点为:通过单个基因导入或敲除，能够得到糖代谢中某个基因作用的关键信息，扩充了对糖尿病发病机制的探索。但是，2 型糖尿病是多基因与环境共同作用的结果，并非少数基因的作用，且该技术要求高，成本高，周期长，不适于大批量造模，使其应用受限。

总之，目前应用最广泛的还是诱发性2 型糖尿病模型，特别是高热量饮食联合低剂量STZ 诱导的2 型糖尿病模型。条件许可的情况下，也可选用自发性糖尿病模型。而转基因模型目前尚处于探索阶段，相信在不远的将来，转基因动物模型将为2 型糖尿病研究提供更科学有效的工具。研究者应根据研究目的、模型特点、实验条件等具体情况，合理选择不同的模型，这对于深入研究糖尿病的病因、发病机制及防治是至关重要的。

4 2型糖尿病鼠类模型目前存在问题

目前2 型糖尿病鼠类模型仍存在许多亟待解决的问题，如:仍缺乏系统规范的标准，包括2 型糖尿病鼠类模型确立的标准，以空腹血糖还是OGTT 糖负荷后血糖为标准?切点是多少?以及病理形态学、功能或分子水平改变出现的时间段、程度及测量评估标准仍需系统的研究。

5 总结与展望

随着对糖尿病研究的逐步深入，相应动物模型的发展势在必行，并且随着分子生物学的快速发展，发现2 型糖尿病相关的致病基因越来越多。将来应尝试建立一种协同多基因和环境因素的更为完善的2 型糖尿病模型，使其更接近人类的疾病特征，以便为2 型糖尿病的临床防治提供良好的平台。

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