PhoPR双组份系统在结核分枝杆菌致病机制中的研究进展

邬 博，张万江

结核病是由结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis, MTB)引起的传染性疾病，其主要传播途径是通过气溶胶方式经呼吸道感染机体引起肺结核。自MTB发现至现今，其仍旧是致死率较高的单一致病菌。并且随着广泛耐药和多重耐药结核杆菌菌株的出现，以及伴发有艾滋病患者的增加，致使结核病的防治工作更加严峻。而目前关于结核杆菌的致病机制还未完全阐明。PhoPR双组份信号转导系统(two-component signal transduction system, TCS)作为结核杆菌感应外界环境变化，并将这些变化信号传递到细胞内，引起细菌做出相应应答调控的一种系统，其在MTB适应宿主体内微环境变化的调控方面发挥了重要作用。随着对PhoPR TCS认识不断深入，PhoPR TCS在结核杆菌生理功能、代谢的调控方面中的重要性和关键性，特别是在细菌的致病机制的调控作用愈来愈受到关注。

1 PhoPR TCS概述

TCS作为重要的感应环境变化，并作出调控应答的系统，在细菌感应宿主微环境的变化以及适时地发挥调控应答等方面发挥了重要作用。1986年Ninfa和Magasnik在研究大肠埃希菌氮调节蛋白时，首次发现了TCS[1]， 随后研究者在结核杆菌中发现了DosS/DosT-DosR、PhoP-PhoR、MprA-MprB、TcrX-TcrY、senX3-regX3、PrrA-PrrB、TrcR-TrcS、MtrA-MtrB等12个完整的TCS。

其中PhoPR TCS作为12个双组份系统中最基本、最重要的感应外界环境变化，并作出相应应答的调控系统，其在结核杆菌适应环境变化调控方面有着重要作用。目前对PhoPR TCS的结构功能研究发现，PhoPR TCS是由两个基本的元件构成，其中PhoR基因编码的膜结合的组氨酸激酶感应蛋白(Histidine Kinase HK)，是一个保守的蛋白结构，主要负责感应接收外界环境变化的各种信号，并将这些信号传递给胞内的反应调节蛋白(Response Regulator,RR)，而RR是由PhoP基因编码的，并由两个区域组成：N末端接受区域包含了一个保守的磷酸化位点和几何结合域的(α/β)5拓扑结构，C末端效应区域包含了一个有翼段的螺旋-转角-螺旋的DNA结构域[2]。其中N末端的接受域主要负责接受来自PhoR蛋白的磷酸化信号；而C末端的效应域主要负责与所要调控的靶基因结合，调控基因的转录表达。Pathak[3]等人研究发现在这两个功能域之间还存在一个有11个氨基酸残基长度的连接子，它将PhoP蛋白的两个功能域连接起来，并且调控着域间的相互作用。而且这个连接子可通过改变自身构象，将N端接受域的磷酸化信号传递给C末端的结合域，促使C末端的DNA结合域与相应的靶基因结合，发挥调控基因转录的作用。因此认为连接子在域间的相互调节中具有重要作用。并且PhoP蛋白域间相互效应可能是导致依赖性磷酸化高亲和DNA的调节结构[4]。此外，有研究结果显示DNA结合域能够结合到DNA序列的二聚识别串联重复结合位点上，这个结合位点位于靶基因的调节启动子的-35区[5]。Cimino[6]等对PhoP蛋白的C末端DNA结合域所结合到的靶基因(msl3，pks2，lipF，fadD21基因)位点序列进行了研究，证实了PhoP蛋白结合在参与调控靶基因的上游共有序列上，这个共有序列由两个直接重复子DR1，DR2和第3个相关的重复子DR3组成。在某些情况下，DR3对于PhoP蛋白结合到DR1和DR2具有重要作用。并且这个共有序列可被用于筛选全基因组中被PhoPR TCS直接调节的相关基因。而RR的主要功能是调控细胞内相应的靶基因进行转录翻译相关蛋白，使这些蛋白发挥生物学效应，有利于MTB适应外界环境的改变，如低氧、镁浓度改变以及酸性环境等。

2 PhoPR TCS与结核杆菌的毒力

结核杆菌的毒力因子可根据其毒力决定簇的功能、分子结构特点以及细胞内的定位分为以下几个方面：(1)脂质和脂肪酸的代谢产物，包括胆固醇的分解代谢产物；(2)细胞膜蛋白，包括细胞壁蛋白、脂蛋白和分泌系统蛋白；(3)抑制巨噬细胞抗菌效应的蛋白，包括参与对活性氧/氮应激的反应蛋白以及阻止巨噬细胞吞噬体成熟和抑制细胞凋亡的蛋白；(4)蛋白激酶；(5)金属蛋白酶类；(6)输入、输出的金属转运蛋白；(7)调控基因表达调控子，包括双组分系统、sigma因子和其他转录调节子；(8)未知功能蛋白，包括PE和PE-PGRS蛋白家族；(9)其他毒力蛋白[7]。

结核杆菌的毒力因子在细菌的致病性上具有重要作用，而PhoPR双组分系统在细菌毒力方面发挥着重要的调控作用[8]。RD1作为MTB毒力必需的基因区域[9]，它存在于致病结核杆菌复合群中。其中 PhoPR TCS参与调节RD1区域中的许多基因的转录表达，有一些基因是与介导毒力密切相关的基因。EspB基因位于RD1区的延伸区，是由1 383个碱基对构成的可以编码466个氨基酸的基因。其编码一种分泌型毒力蛋白，该蛋白最先在海分枝杆菌中发现，并命名为ESX-1分泌蛋白Mh3881c，通过深入研究发现该蛋白在结核杆菌国际标准强度株(H37Rv)中也存在着其同源基因Rv3881c，该基因参与了致病性结核杆菌ESX-1系统中EspB蛋白的分泌。EspB蛋白在分泌过程中的C末端被裂解为50 kDa和11 kDa两个蛋白片段，进一步研究发现EspB蛋白的C末端与ESAT-6具有直接相互作用，并且对保持ESAT-6在细胞内的浓度水平是必需的[10]。研究还发现在分泌过程中EspB、ESAT-6和CFP-10的分泌是相互依赖的，对结核杆菌在巨噬细胞内的生长具有重要的作用，并且对巨噬细胞吞噬体的成熟发挥着抑制作用。在敲除EspB基因的突变菌株中，该菌株的毒力则几乎丧失[11]，可见EspB在细菌毒力方面的作用似乎比ESAT-6和CFP-10更显著。有研究表明，在敲除野生型结核杆菌菌株的PhoP基因后，细菌分泌表达EspB蛋白的量较亲本野生型菌株显著降低[12]。这个结果表明PhoPR TCS对EspB蛋白表达可能存在着调控作用，但是目前关于PhoPR TCS是否对EspB基因存在直接调控作用未见报道，同时在不同毒力结核杆菌菌株中EspB蛋白分泌表达量是否受PhoPR的调控仍需要进一步研究。此外有研究表明，在不同毒力结核杆菌菌株中，结核杆菌国际标准无毒株(H37Ra)、卡介苗菌株(BCG)以及PhoP缺失突变株在感染巨噬细胞后可导致细胞凋亡的时间都较H37Rv菌株缩短[13]。这表明PhoPR TCS在不同毒力菌株中调控结核杆菌的毒力可能存在差异，但是目前关于在不同毒力结核杆菌菌株中PhoPR TCS调控细菌的毒力基因的表达差异的变化未见明确的报道。

3 PhoPR TCS与结核杆菌的脂质

结核杆菌是一种兼性细胞内寄生菌，它不含有内毒素，也不会分泌外毒素和侵袭性酶类，其致病性主要与占细胞壁干重60%以上的脂质成分密切相关。这些脂质物质不但有助于结核杆菌抵御外界不利的生活环境，同时也在细菌逃避宿主免疫系统过程中发挥了重要作用。PhoPR TCS调控的多数靶基因参与合成以酰基海藻糖为基本物质的脂质。而在PhoP基因缺失突变菌株中因不能够合成以酰基海藻糖为基本物质的脂质[14]，导致其毒力减弱。并进一步发现PhoPR TCS正性调控的基因如pks3, rv1184c, fadD21和pks2都参与了以酰基海藻糖为基本物质的脂质合成[15]。此外，PhoPR TCS调控的fas基因编码一种脂肪酸合成酶，这个酶可以与FAS II系统联合促使结核杆菌前体细胞合成分枝菌酸。而分枝菌酸是细菌胞壁的主要成分，其与海藻糖构成了海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate,TDM)或称为“索状因子”(cord factor)。后者可以导致机体产生肉芽组织、影响细胞膜的融合并对线粒体有毒性作用[16]。

4 PhoPR TCS与宿主巨噬细胞的相互作用

结核杆菌通常形成气溶胶方式经呼吸道感染宿主，进入肺脏的细菌可被巨噬细胞吞噬。其中大部分细菌可以被巨噬细胞杀死并清除到体外。但有少量的结核杆菌在巨噬细胞内存活下来，但是其生存将会遭遇细胞内不利环境的挑战，包括活性氧/氮，酸性环境、低氧、营养缺乏等。结核杆菌为了逃避这些恶劣的生存环境，可以通过免疫逃避、休眠、以及降低自我增殖等多种应对方式避免宿主巨噬细胞对其杀伤，从而持久的寄生在细胞内。其中PhoPR TCS是结核杆菌感知微环境变化的主要系统，结核杆菌可通过这个系统对感知到的变化信息进行分析处理后，并调控相应靶基因的表达来使细菌适应微环境的改变。因此结核杆菌PhoPR TCS与宿主巨噬细胞的相互作用对结核杆菌在细胞内的长期生存有着重要的作用。

参考文献：

[1]Ninfa AJ, Magasanik B. Covalent modification of the glnG product, NRI, by the glnL product, NRll, regulates the transcription of the glaALG operon inEscherichiacoli[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986, 83(16): 5909-5913.

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