乳用动物乳腺特异性miRNAs研究进展

曲波，王春梅，仇有文，袁肖寒，甄贞，姜毓君

（东北农业大学a.乳品科学教育部重点实验室，b.生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨150030）

0 引言

2008年12月，农业部发布的《乳用动物健康标准》中指出：“乳用动物是指用于生产供人类食用或加工用生鲜乳的奶牛、奶山羊等动物”。乳腺是乳用动物的生产器官，可以将营养素转化为乳成分并形成乳汁。乳腺的发育涉及众多激素和细胞因子参与。miRNAs（microRNAs）是一种广泛存在的、对基因表达进行微调的分子，大量研究证实，miRNAs参与乳腺发育、泌乳和退化过程的诸多调节途径[1-2]。

目前，有关miRNAs在乳腺发育和泌乳活动中作用和机制的研究还主要集中在人和小鼠等模式生物上，虽然与乳用动物乳腺特异性miRNAs有关的报道并不多，但相关的研究正逐渐成为乳腺发育与泌乳生物学研究的热点[3]。本文就近年来奶牛与奶山羊乳腺miRNAs研究工作做一概述，为未来此领域的研究提供依据。

1 miRNAs与乳腺生物学

1.1 miRNAs 的预测与鉴定

miRNA（microRNA）是一类长约22 nt的内源非编码小分子RNA，由长约70 nt的发夹状前体RNA（pre-miRNA）加工而成。已有研究证实，miRNAs在转录后水平迅速灵敏地调节着基因的表达，广泛参与细胞发育、分化、增殖、凋亡、代谢、肿瘤转移等多种生物学过程[4]。

虽然miRNAs的研究历史很短，但其进展势头十分迅猛，迄今miRBase收录的miRNAs已超过3万条。近年来，随着miRNAs研究的深入，各种miRNAs检测技术也是层出不穷，但主要还是分为3类。一是传统的克隆方法，这也是最早被应用于检测miRNAs领域的方法之一；二是新一代测序技术（next-generation sequencing，NGS），实现了高通量筛选新的miRNAs；最后是生物信息学方法，该法最具效率，应用最广，为NGS的高通量筛选提供技术保证，已成为寻找和鉴定miRNAs及靶基因的主要方法[5]。随着人们对miRNAs及其靶基因性质和特点的深入了解，以及物种基因组信息的完善，相信会有更多的miRNAs和靶基因被发现。

1.2 miRNAs在乳腺发育中的作用与机制

乳腺作为具有泌乳功能的哺乳动物特有器官，在其生长发育过程中经历着细胞生长、分化、增殖、凋亡等生命过程。哺乳动物生殖周期中乳腺的功能性分化是至关重要的。乳腺发育和泌乳活动都是通过神经和内分泌系统进行调节。此外，激素和生长因子在乳腺不同阶段的发育过程中起重要作用。miRNAs作为广泛存在的转录后调控机制，主要靶向于信号分子、结点蛋白及信号蛋白，可能对传统的神经和内分泌系统细胞因子水平调节引入新的调控机制。随着miRNAs的不断发现和深入探索，有关miRNAs对乳腺发育和泌乳功能调控的研究也逐步展开。

Sdassi等人应用克隆方法在乳腺中发现了24个乳腺发育的相关miRNAs基因并鉴定了其中6个，发现它们有一定的组织特异性[6]。李晔等发现，miR-195和miR-365对小鼠乳腺上皮细胞活性及增殖能力有抑制作用，还可降低小鼠乳腺上皮细胞乳糖分泌，抑制乳腺上皮细胞的泌乳能力[7]。李慧铭等应用脂质体转染法结合生物信息学、荧光定量PCR等技术证明，miR-142-3p对小鼠乳腺上皮细胞活性及增殖能力有抑制作用，对小鼠乳腺上皮细胞中酪蛋白和甘油三酯的合成分泌有抑制作用，其靶基因为PRLR[8]。

乳腺组织特异性miRNs的陆续发现及其相关靶基因的确定，初步揭示了其在乳腺发育和泌乳机能分化中的调控作用，而且其调控作用可能是一种调控网络，但目前miRNAs调控哪些细胞因子、哪些信号转导通路，它们与信号分子的关系如何等问题，都亟待去揭示和探讨。

2 乳用动物乳腺miRNAs的筛选与鉴定

2.1 奶牛乳腺miRNAs的筛选与鉴定

2009年，牛全基因组测序完成后，与奶牛健康、疾病、乳品质相关的功能基因研究逐渐成为热点，有关奶牛乳腺miRNAs的研究也较其他反刍动物多[9]。

早在2007年，Gu等就通过克隆的方法从牛乳腺和脂肪组织中鉴定出59个不同的miRNAs。其中miR-21、miR-23a、miR-24和miR-143在奶牛乳腺组织中大量表达[10]。

相对于传统克隆方法的费时费力，高效、快速的大规模测序技术逐渐应用到奶牛乳腺miRNAs的筛选上来。2012年，李真等以泌乳期和非泌乳期奶牛为对象，采用Solexa高通量测序技术共获得884个奶牛乳腺miRNAs序列，其中已知序列283条，保守序列96条，新发现序列505条，同时获得两个时期miRNA的差异表达谱。在检测到的69条差异miRNAs中，有45条miRNA在泌乳期表达显著下调，表明miRNA在奶牛泌乳过程中存在重要的调控作用[11-12]。

值得注意的是，自Weber等于人母乳中筛选检测到miRNAs以来，人母乳中已检测到多种miRNAs[13]。近年来，有报道指出牛乳中也含有miRNAs。2012年，Izumi等通过基因芯片分别检测健康荷斯坦牛初乳与常乳，结果共检测到102个miRNAs，其中初乳中有100个，常乳中含53个，有51个miRNAs在初乳与常乳中都存在。该团队还筛选出一些与免疫和发育密切相关的miRNAs进行荧光定量PCR验证，包括miR-15b、miR-27b、miR-34a、miR-106b、miR-130a、miR-155和miR-223等，结果全部为阳性，而且初乳中的表达水平显著高于常乳，暗示这些miRNAs与器官发育和免疫功能调节有关[14]。

2.2 奶山羊乳腺miRNAs的筛选与鉴定

山羊是最早被人类驯化的动物之一，但其基因组测序工作却远落后于其他家畜，这也使山羊miRNAs的研究工作极大受限。直到2012年底，山羊的基因组序列组装才初步完成，该研究整合使用了NGS和最新的DNA单分子光学作图技术，成功克服了山羊基因组的组装难题，提供了首个小型反刍动物参考基因组[15]。尽管山羊基因组序列信息仍不完整，但随着高通量技术的运用和生物信息学的迅猛发展，有关山羊乳腺miRNAs的挖掘工作还是逐步开展起来[4,16]。

2012年，Ji等以崂山奶山羊不同发育时期乳腺为研究材料，分别构建了泌乳初期、泌乳高峰期、泌乳末期三个miRNA文库，并用Solexa高通量技术进行测序、筛选，结果在乳腺组织中获得已知miRNAs 336个，新miRNAs 50个，显著差异表达miRNAs 189个，表 达 丰 度 最 高 的 包 括 let-7a、let-7b、miR-143、miR-378、miR-148a等。通过进一步的生物信息学分析共获得68条显著富集的信号通路，且均富集到了MAPK、Wnt、Insulin、Jak-STAT等与泌乳有关的信号通路上[17-19]。随后，Dong等通过生物信息学方法对其中一些差异显著的miRNAs进行了靶基因预测与分析，结果获得了22个miRNAs的215个靶基因，预示着它们在奶山羊乳腺发育过程中具有重要的调控功能，如与乳成分合成与运输密切相关的miR-378、miR-423-5p和miR-7等[20]。同年，Li等对西农萨能奶山羊干奶期和泌乳高峰期乳腺组织miRNAs转录组进行了比较研究，发现差异表达的miRNAs中包括346个保守的miRNAs和95个新miRNAs，其中表达差 异 较 高 有 miR-288、miR-199a、miR-451、miR-98、miR-247、miR-25、miR-199b、miR-128、miR-145、miR-222、miR-181b等[21]。

此外，还有一些研究团队着眼于山羊睾丸、肌肉等特异miRNAs的鉴定工作，也都取得了较好的结果。

3 miRNAs对乳用动物乳腺发育和泌乳的影响

3.1 miRNAs对奶牛乳腺发育和泌乳的影响

奶牛乳腺发育与泌乳是一个复杂的过程，受到众多调节因素的支配。近年来，miRNAs的调控作用越来越受到关注[22]。

大量研究证实miRNAs对奶牛乳腺发育与泌乳有调节作用。Li等利用体外细胞培养和qPCR等技术研究miR-15a在乳腺发育过程中的作用，结果发现，miR-15a的靶基因为生长激素受体，通过抑制其表达限制奶牛乳腺上皮细胞的增殖和酪蛋白的分泌[23]。Wang等发现多数miRNAs在奶牛泌乳期的表达显著高于干乳期，比如miR-221、miR-33b、miR-31等，提示miRNAs对相关功能基因的调控与泌乳阶段有关[24]。李真等证实，miR-484可靶向作用于牛己糖激酶2（Hexokinase 2,HK2）mRNA的3’UTR序列，通过抑制己糖激酶的活力，下调细胞对葡萄糖摄取能力[11]。

奶牛乳房炎是影响乳腺健康和正常生理功能的关键因素，目前有关miRNAs参与乳腺免疫的研究逐渐受到关注。高迁移率族蛋白（High-mobility group box protein,HMGB）是一种高度保守的核蛋白，可调节细胞免疫应答。有报道指出，在乳房炎感染的奶牛乳腺组织 中 ，参 与 调 控 HMGB3[25]的 miRNAs，包 括miR-17-5p、miR-20b和miR-93，以及调控HMGB1[26]的miR-223都出现显著的表达下调，表明这些miRNAs可能参与到乳腺免疫活动。2012年，Naeem等研究发现，在用乳房链球菌感染健康乳腺组织后，miR-181a、miR-16a和 miR-31大约下调 3-5倍，miR-223上调2.5倍。此外，miR-16a和miR-31推定的靶基因与免疫系统、信号转导相关。其中，miR-31推定的靶基因出现在细胞生长与死亡、细胞通信等生物通路，并对脂类代谢有强烈抑制作用[27]。2013年，Lawless等采用高通量测序技术检测乳房链球菌感染的奶牛乳腺上皮细胞，结果发现1300条已知牛成熟miRNAs序列及20多条新miRNAs。其中，21条miRNAs在感染后表达差异显著，生物信息分析显示这些miRNAs在免疫系统中有重要作用。可见，在乳腺组织感染后，有关免疫、代谢和细胞增殖相关的信号通路都有可能部分地、在基因转录水平受miRNAs介导[28]。

3.2 miRNAs对奶山羊乳腺发育和泌乳的影响

尽管奶山羊具有重要的经济价值，但相当于奶牛来说，目前关于miRNAs在奶山羊乳腺发育和泌乳过程中调控作用的研究要少得多。

2013年，纪志宾等通过高通量测序、双荧光素酶报告基因分析法和qRT-PCR等技术分析miR-143在奶山羊乳腺发育中的作用，结果发现：miR-143及其潜在靶基因1GFBP5在不同泌乳时期乳腺组织表达趋势相同，均在泌乳高峰期低表达。同时，miR-143可抑制乳腺上皮细胞的增殖，并促进其凋亡。进而可以推断，miR-143可能通过调控IGFBP5表达促进乳腺细胞的凋亡，从而参与乳腺的发育与泌乳[19]。

2012年，林先滋等采用数据库预测和自由能评估法，分析40个已知参与乳腺脂肪酸调控的基因3’-UTR上潜在的miRNA结合位点，筛选出9个可能与山羊乳腺脂肪酸代谢相关的miRNA[29]。随后，他们通过构建重组腺病毒表达载体，在奶山羊乳腺上皮细胞中过表达mi-200a，结果引起10个与乳脂合成相关基因mRNA表达量下调，6个上调。其中脂肪酸从头合成相关基因FASN、脂滴生成相关基因TJP47（维脂滴蛋白)及脂肪酸运输相关基因FABP4（脂肪酸结合蛋白）降幅较大；而甘油三酯生成相关基因DGATl（甘油二脂酰基转移酶1）和脂解相关基因HSL（激素敏感酯酶）则增幅靠前[30]。2013年，张犁苹等利用qRT-PCR获得山羊miR-200家族乳腺组织表达谱，通过分析miR-200家族各成员之间与山羊乳成分的相关性，发现miR-200家族可能对山羊乳蛋白及乳脂合成具有一定的调控作用，其中miR-200a/miR-141靶向作用于在乳脂合成中起关键作用的基因STAT4[31]。Lin等采用高通量测序技术大规模地挖掘泌乳期山羊乳腺miRNA，共计发现823个保守的miRNA，其中30个在乳腺中高表达，包括miR-103；在乳腺上皮细胞中过表达miR-103，会提高乳脂合成相关基因的转录，从而上调脂滴的形成、甘油三酯的积累及不饱和脂肪酸的比例，表明miR-103表达水平与哺乳密切相关[32]。随后，该研究小组对miRNAs协同调控奶山羊乳腺上皮细胞中乳脂合成等问题进行了深入研究，他们选取miR-23a、miR-27b、miR-103和 miR-200a等 4个miRNAs进行分析，发现 3 对 miRNAs（miR-23a和miR-27b、miR-103 和 miR-200a、miR-27b 和miR-200a）间有较强的协同调控作用，为今后的乳脂合成分子调控网络研究提供有效帮助[33]。

尽管关乳用动物乳腺特异性miRNAs的研究得以有效展开，但相对于人、小鼠等模式生物来说，还有很大的提升空间，乳用动物乳腺miRNAs的发现与鉴定还远远不够，对其具体功能的研究也急需深入。

4 展望

乳腺是乳用动物的生产器官，可以将营养素转化为乳成分并形成乳汁，是多产奶和产好奶的首要条件。因此，乳用动物的乳腺重在健康发育和功能正常。从人类的营养需求和动物福利出发，如何最大化地提高乳产量和乳质量又不影响泌乳乳用动物的身体健康、繁殖能力和生产寿命，一直是乳腺发育与泌乳生物学研究的重要科学使命。随着奶牛全基因组信息的完成以及山羊全基因测序工作的有效开展，乳用动物乳腺miRNAs相关研究得以不断深入，这必将带动整个乳腺发育与泌乳生物学研究的快速发展，其前沿研究领域也将逐渐趋向于泌乳功能基因组学、泌乳核心信号转导途径及其调节研究等，进而深刻揭示乳腺发育与泌乳的基因调节机理。

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