益生乳酸菌对氟喹诺酮类药物耐药机制的研究进展

马春艳，李少英 *，宋晓敏，李 贞，李淑芬

（1.内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学生命科学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌是无处不在且广泛分布的微生物，作为益生菌来源的重要菌群之一，对食品、农业、生物技术以及制药行业都是非常重要的，这使得其的安全特性、生理特性和遗传特性成为研究者们研究的主题。在生产各种发酵乳制品时，如奶酪、酸奶和发酵牛奶，乳酸菌是使用最广泛的发酵剂。近年来研究表明，双歧杆菌、植物乳杆菌等益生乳酸菌对抗革兰氏阴性菌的抗微生物药具有一定的耐药性。抗微生物药尤其是氟喹诺酮类药物因其广谱杀菌活性和良好的药动力学特点，在临床治疗感染性疾病中得到持续广泛的应用。在抗生素选择压力下造成很多耐药乳酸菌的出现及其耐药率的提高。当耐药乳酸菌将携带的可转移的耐药因子传递给其他乳酸菌或者致病菌，将引起无法估量的后果。如ROSANDER A等[1]报道商用益生菌罗伊氏乳杆菌ATCC 55730存在潜在的可转让的抗性基因。因此，益生乳酸菌的生物安全问题需要被高度重视。基于上述原因，认识和了解乳酸菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制，为安全合理有效利用益生乳酸菌提供一定参考，同时为疾病的治疗提供新的思路，也丰富临床用药依据。

1 氟喹诺酮类药物

喹诺酮类药物是一类化学合成类抗菌药物，其基本结构是1，4-二氢-4-氧-3-喹啉羧酸。第一代喹诺酮类药物是LESHER G Y等[2]在1962年发现的，由于其对厌氧菌无活性和革兰氏阳性菌无作用，加之其抗菌谱窄，药代动力学和安全性不理想，现已被取代。随后逐步对第一代喹诺酮类药物结构进行修饰，得到第二代喹诺酮类药物，其主要用于治疗肠道的感染。直到1978年，日本杏林公司[3]在C-6引入F 原子后得到第三代氟喹诺酮类药物，其杀菌作用强且生物利用度高等特性使其得到广泛地应用。第四代氟喹诺酮类药物与前三代抗菌药相比其抗菌能力进一步增强，尤其对革兰氏阳性菌[4]。氟喹诺酮类药物因其广谱杀菌活性和良好的药动学等特点，在临床治疗感染性疾病中得到广泛的应用。然而，持续广泛的应用甚至滥用氟喹诺酮类药物的现象，造成很多耐药菌株的出现及其耐药水平的提高。

2 乳酸菌耐氟喹诺酮类药物的原因

乳酸菌耐药性的原因可分为获得耐药性和天然耐药性。大多数研究认为乳酸菌耐药性来源于3种途径：①天然存在的耐药性，是微生物为适应环境其自身通过改变碱基位置从而出现的耐药性，如双歧杆菌对萘啶酸和氟哌酸具有固有的耐药性，嗜酸性乳杆菌对环丙沙星具有固有耐药性[5]；②抗生素选择性压力，是细菌通过基因突变和自身代谢调节来生存和繁殖；③可移动基因元件（如质粒、整合子、转座子等）在细菌间的转移[6-8]。细菌耐药性是生物的自然现象，还可能是由于细菌的种、属特性不同而造成的耐药性。细菌对某种抗微生物药产生耐药性，就难以恢复对该抗微生物药的敏感性。喹诺酮类抗菌药的投入使用时间要短于其他抗菌药，李巧芳[9]研究发现，细菌耐氟喹诺酮类药物水平呈明显上升的趋势。近年来，国内已经有许多人对乳酸菌的抗生素敏感性进行了研究[10-12]，而其耐药机制还不明确。所以对乳酸菌耐氟喹诺酮类药物的机制进行全面深入研究十分紧迫重要。

3 乳酸菌对氟喹诺酮类药物耐药的机制

国内外研究较多的是致病菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制，而对于乳酸菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制的报道却甚少。目前研究认为，乳酸菌对氟喹诺酮类药物耐药的机制主要有3个方面：靶位的突变；外排泵的作用；质粒介导。

3.1 靶位的突变

在细菌细胞内，喹诺酮类药物的作用靶位是脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ[13]。DNA旋转酶在DNA复制和转录的起始阶段起重要作用。DNA旋转酶包含gyrA和gyrB基因，其中gyrA基因与DNA双链的断裂和重接有关，gyrB基因与三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的水解有关。在DNA复制后期的姊妹染色体分离过程中拓扑异构酶Ⅳ起着重要作用。拓扑异构酶Ⅳ有parC和parE基因，其中parC和gyrA、parE和gyrB具有高度同源性。氟喹诺酮类药物能抑制细菌的DNA旋转酶和拓扑异构酶IV的合成，药物结合到酶-DNA二聚体上，稳定共价结合的酶-酪氨酰-DNA磷酯键，形成三聚体复合物阻止DNA复制，导致细胞死亡[14]。

拓扑异构酶Ⅳ和DNA旋转酶都是细菌细胞生长繁殖不可或缺的酶，由于编码DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因发生突变，1997年MARTIN J G等[15-16]研究发现突变位点多发生于parC和gyrA基因位点，即酶蛋白分子和DNA链结合的区域，这一区域发生氨基酸的突变将会影响到氟喹诺酮类药物的结合。gyrA的最常见突变位点为83位及87位，parC的最常见位点为80位及84位，而gyrB和parE的突变发生率相对较低。1996年，JANOIR C等[17]研究发现革兰氏阳性肺炎链球菌高水平耐培氟沙星、环丙沙星和司帕沙星是parC和gyrA共同突变导致的。通常对于肠杆菌科细菌在该喹诺酮耐药决定区（quinolone resistance-determining region，QRDR）区域出现多个突变位点就可以带来明显的临床耐药性，如空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni），DNA旋转酶发生Thr86-Phe，Asp90-Asn，Ala70-Thr突变[18-19]。以上耐药机制的报道是对于细菌而言的，对于乳酸菌耐氟喹诺酮类药物的机制还未有报道。直到2007年，ANJA S等[20]研究发现乳酸菌对环丙沙星产生耐药性，他们研究了gyrA和parC基因的QRDR区，未发现典型的突变现象，并且提出耐药基因可能存在但没有表现出来。2008年，李少英[21]研究发现双歧杆菌和乳杆菌属的菌株对喹喏酮类药物（左氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星）产生耐药与DNA 旋转酶gyrA基因突变有密切关系，张燕燕[22]研究发现gyrA基因突变是乳酸菌对环丙沙星产生耐药性的主要机制。2011年，芮萍等[23]研究发现parC单一位点突变引起猪链球菌对氟喹诺酮类药物低水平耐药，而parC和gyrA双位点突变引起其高水平耐药。2012年，霍小琰[24]研究发现乳酸菌耐氟喹诺酮类抗菌药（环丙沙星和诺氟沙星）是由于gyrA基因位点发生突变造成的，证实乳酸菌对喹诺酮类抗菌药产生的耐药性与菌体DNA拓扑异构酶ⅡgyrA基因突变有直接关系。2013年姚杰等[25]研究发现，粪肠球菌耐氧氟沙星、环丙沙星及诺氟沙星等6种氟喹诺酮类药物是gyrA和parC突变导致的。关于突变发生率相对较低的gyrB和parE与乳酸菌的耐药性关系国内还未有报道，所以在此研究基础上应该作进一步的研究。

3.2 外排泵作用机制

BALL P R等[26-27]在20世纪80年代研究大肠杆菌对四环素的敏感性发现主动外排系统（active efflux system）。细菌利用外排泵系统排出体内对自己有害的物质害，以适应周围环境来更好的生长繁殖。外排泵蛋白是革兰氏阳性细菌对氟喹诺酮类药物耐药的一种非特异性重要途径。1999年，贾蓓等[28]研究发现仅主动外排系统单独作用就可引起细菌高水平耐药的产生。2000年，POOLE K[29]研究发现主要易化超家族（major facilitator superfamily，MFS）型转运蛋白在革兰氏阳性细菌耐氟喹诺酮类药物中占主导地位。2005年，张海旺等[30]也证实了细菌耐氟喹诺酮类药物是单独的主动外排机制导致的。2009年，LI X Z等[31-33]报道，氟喹诺酮类药物在细菌细胞内积累到一定浓度来抑制DNA和蛋白质的合成，活化的外排泵系统依靠跨膜转运时质子泵或钠离子的电化学梯度的能量，使细菌细胞内的抗菌药排出体外，降低或消除了药物对细菌的抑制。以上外排泵机制的研究是基于致病菌耐药性而言的，其中对外排泵介导的益生菌耐药性的研究，李少英[21]在2008年提出用2，4-二硝基酚来抑制双歧杆菌和植物乳杆菌的主动外排系统，研究结果显示，双歧杆菌和植物乳杆菌存在主动外排系统介导的对环丙沙星抗菌药的耐药性。同年张燕燕[22]研究表明双歧杆菌有外排系统作用介导的对环丙沙星耐药的机制。除此之外，国内还尚未有关报道，所以还有待进一步的研究。

3.3 质粒介导

研究表明，许多细菌的耐药性是通过质粒来传递的，研究发现其传递能量来自抗微生物药选择压力[34]。目前研究发现乳酸菌耐喹诺酮类药物是由质粒抗性基因介导的主要有qnr家族[35-36]。qnr家族中qnrA竞争性抑制DNA旋转酶与DNA的结合，从而抑制了喹诺酮类药物对菌体的抑制或杀灭[37]。目前研究发现qnr家族流行较广的有qnrS、qnrD和qnrB[38]。qnr家族基因的表达通常仅能传递低水平耐药，但是携带该质粒的细菌更易发生基因突变[35]。2007年李显志等[39]研究发现aac（6′）-Ib-cr使环丙沙星和诺氟沙星药物的化学结构中哌嗪环乙酰化，从而导致细菌对抗微生物药耐药水平降低。此外，AGUADO-URDA M等[40]研究发现格氏乳球菌的质粒pGL4中的orf2基因、质粒pGL5中的orf35基因与抗药性有关，其中orf2基因编码的含107 个氨基酸的蛋白质可以把药物泵出细胞膜外；orf35基因编码五肽重复蛋白家族高浓度血小板血浆（platelet-richplasma，PRP），关于PRP的生物功能尚不清楚，只是发现与qnr蛋白相关。FUKAO M等[41]研究发现，短乳杆菌KB290的质粒pKB290-2和质粒pKB290-3中的一段基因编码多重耐药转运蛋白。国内对于质粒介导的益生乳酸菌耐氟喹诺酮类药物机制的研究甚少，有待进一步的研究。

近些年来，研究人员发现革兰氏阳性细菌中有群体效应分子，其能提高细菌对不同环境的适应能力[42]。那么群体效应是否是益生乳酸菌对氟喹诺酮类药物耐药的又一个机制，这还有待进一步的研究。另外，目前已有研究认为乳酸菌对氨苄西林、红霉素、四环素、万古霉素和链霉素产生耐药性是由于这些乳酸菌产生生物膜导致的[43]。乳酸菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性是否与生物膜的形成有关，目前国内尚未有报道，还有待进一步研究。

4 小结

益生乳酸菌对氟喹诺酮类药物产生耐药主要原因是靶位的突变，且耐药水平的提高与靶位突变的数目成正比。外排泵机制是导致益生乳酸菌耐多种药物的重要原因。质粒上的喹诺酮类药物抗性基因aac（6′）-Ib-cr和qnr促使了其多药耐药性且提高了耐药水平。益生乳酸菌对喹诺酮类药物产生耐药性，亦或多重耐药是这3种耐药机制单独存在或同时存在作用的[44]。另外，细菌群体效应的存在和细菌生物膜的形成也可能导致益生乳酸菌对氟喹诺酮类药物产生耐药。特别引人关注的是，在将来可能出现耐药基因的进化及新型耐药特征的出现[45]。抗生素的使用和益生乳酸菌耐药性发生传播有直接的因果关系，因此对益生乳酸菌耐氟喹诺酮类药物的机制需要进行全面深入的研究。

5 展望

益生乳酸菌对氟喹诺酮类药物耐药机制的相关进展警示我国对这方面的研究甚少。作为现在全球抗生素滥用最严重的国家，益生菌耐药性也是最易出现的国家，这就要求我们不仅要进行前期的生物安全测试和后期的跟踪检测，如GUILLARD T等[46-47]使用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术建立了可以快速检测出aac（6′）-Ib-cr、qepA和qnr等抗性基因的方法。还要加大力度全面深入的研究益生乳酸菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制，为选育对喹诺酮类抗菌药具有抗性且其抗性基因相对稳定，不会在细菌间传递转移的益生乳酸菌奠定基础。经研究发现，益生乳酸菌对抗菌药具有耐药性，而且这种耐药基因不会发生转移，就可以将益生乳酸菌微生态制剂与喹诺酮类抗菌药相结合，来治疗肠道病原菌感染引发的各种肠道疾病，同时可以维持肠道正常菌群的平衡。此外，通过对益生乳酸菌耐药机制的研究可以扩大其微生态制剂的应用范围，这为安全高效地使用益生乳酸菌开辟新的途径。除此之外，我国应开展抗菌药物专项整治活动，如合理用药、研发新结构药物和优化现有药物、加强药政管理、建立广泛的细菌耐药监测网络等。通过对益生乳酸菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制的研究，有助于严谨合理地应用抗菌药物，有助于减少益生菌耐药性发生及传播，有助于延长现有抗菌药物的疗效周期，有助于新型抗菌药物的研发。

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