细菌的纯种分离与培养

2014-02-06 00:51
中国现代教育装备 2014年7期
关键词:纯种培养皿活性污泥

张 娴

同济大学环境科学与工程国家实验教学示范中心 上海 200092

在我们生活的环境中,微生物无处不在。它们个体极其微小,用肉眼难以观察,种类繁多,数量巨大,在人们生活中发挥着重要的作用。微生物可以用于生产抗生素,治疗疾病;也可用于发酵面包、乳酪等食品;还可以用于城市污水处理厂污水的生物处理等。基于微生物的重要作用,有必要对微生物教学与科研进行深入研究,探索其未知规律,以便于人们能够更好地对其加以应用。

通常情况下,微生物是以群体的方式“杂居”在环境中。为了方便进行研究与应用,一般需要先把目标微生物从微生物群体中分离出来,进行纯化,得到其纯种。在环境微生物学实验课程中,细菌的纯种分离与培养实验,其目的是教会学生将细菌从微生物群体中分离纯化出来,最终得到细菌纯种[1,2]。

1 细菌纯种分离方法

在微生物实验中,一般通过单菌落分离的方法获得细菌纯种。所谓单菌落分离,就是让微生物群体在培养基上生长,形成单菌落,然后将目标细菌的单菌落纯化,最终得到目标细菌纯种。由于分离专性厌氧细菌需要专门的厌氧操作箱或者其他类似的仪器设备,其数量有限,短时间内无法满足实验课的需求。因此,在环境专业本科生的实验课中,通常学生分离的是好氧细菌或兼性好氧细菌。针对这两大类细菌,可以通过平板划线法、平板表面涂布法或浇注平板法获得细菌单菌落。

2 实验材料

细菌的纯种分离实验以环境样品作为实验材料,这些环境样品包括从上海曲阳污水处理厂二沉池取来的剩余活性污泥、崇明岛滩涂的土壤以及校园河水等。污水处理厂生化反应池中利用微生物组成的活性污泥具有处理污水的功能,而从崇明岛采集的土壤样品和从校园采集的河水水样都具有一定的代表意义。以这些环境样品作为实验材料,对其进行细菌纯种的分离、纯化,将实验教学与环境问题有机结合,有助于加深环境专业本科生对污水生物处理及土壤、河水微生物的认识与理解,拓宽学生的专业视野,激发学生的好奇心,促进学生创新思维的培养[2]。

3 细菌的纯种分离与培养实验

平板划线法、平板表面涂布法和浇注平板法都是以培养皿作为培养微生物的容器,将适于微生物生长的培养基灭菌、倒平板、冷却凝固后,通过将样品在培养基上划线、涂布样品稀释液或者直接将样品稀释液和培养基混合均匀的方式,使样品中微生物的浓度得到稀释,然后在培养基上生长形成单菌落。虽然这3种实验方法的具体操作有所不同,但是其本质都是将样品进行稀释,使样品中的细菌最终在培养基上形成单菌落,从而得到纯菌。本实验主要学习用浇注平板法分离纯化剩余活性污泥中的细菌[3]。

3.1 实验准备工作

实验开始以前,需要做好实验准备工作。由于实验中学生需要用培养皿、培养基并稀释环境样品,所以准备工作中最重要的是培养皿以及稀释环境样品所用的物品的准备,此外还有培养基的配制。

根据实验需要,每组学生准备若干套培养皿。每套培养皿包括一个培养皿盖和一个培养皿底,这些培养皿都是事先清洗干净并在室温自然晾干的。学生将若干套培养皿按一定的排列顺序放入专门的培养皿罐中,然后放入电热干燥箱中,160 ℃干热灭菌2小时后取出,放在室温下冷却待用。此外,还需要准备1 mL和10 mL的移液管,放入专门的移液管筒中,和培养皿罐一样进行干热灭菌。

由于剩余活性污泥需要被梯度稀释到10-4和10-5浓度,然后再作为实验材料进行细菌分离,所以学生需要先准备一定量的无菌水,以用于活性污泥的梯度稀释。准备无菌水时,需要1个锥形瓶和4支同样大小的试管,锥形瓶中提前加入一些玻璃珠,学生用量筒分别量取90 mL和9 mL的蒸馏水倒入锥形瓶和试管中,塞好棉花塞,包好包装纸,送入高压蒸汽灭菌器121 ℃,0.103 MPa灭菌20 min[4]。

3.2 细菌分离纯化

进行细菌分离纯化时,学生要点燃煤气灯,在火焰旁进行实验操作,尽量达到无菌要求。在取来剩余活性污泥样品后,要首先对其进行梯度稀释。学生用移液管量取10 mL活性污泥样品,将其加入锥形瓶90 mL的无菌水中,塞好棉花塞,摇晃锥形瓶,通过玻璃珠的作用将活性污泥打碎,形成浓度为10-1的均匀混合液,然后用移液管量取浓度为10-1的1 mL混合液,加入到试管9 mL的无菌水中,形成浓度为10-2的混合液,按照相同的方法依次稀释,最终将活性污泥稀释到10-4和10-5浓度,最后用移液管分别取1 mL活性污泥稀释液加入到空的培养皿中,在培养皿盖上写上编号。

在准备好实验样品以后,学生在小铁锅内放入自来水,将已经灭菌并冷却凝固的培养基放进铁锅中,水浴加热,等培养基完全融化以后,将其放到实验台上,室温冷却,等到学生用手触摸盛培养基的锥形瓶不烫手时,就可以倒平板。此时,培养皿中已经分别加入了浓度为10-4和10-5的活性污泥样品,学生左手拿培养皿,用大拇指和食指略微打开培养皿的盖,其余3个手指托住培养皿的底,同时右手拿培养基,在培养皿内倒入少量培养基,使培养基能铺满培养皿底即可,然后将培养皿放在实验台上,轻轻来回转动培养皿,使培养基和活性污泥样品充分混合均匀。待培养基彻底冷却、凝固成平板以后,将其倒置放入37 ℃恒温培养箱内培养24~48小时,就能在平板上观察到若干圆形、颜色均匀、边缘清晰的细菌单菌落。

4 实验效果

通过实验,学生学会使用浇注平板法分离纯化剩余活性污泥中的细菌。实验需要准备培养皿、无菌水、移液管和培养基等物品,并涉及干热、湿热灭菌,锻炼了学生的动手操作能力。在实验过程中,需要先稀释实验样品、将样品加入培养皿,然后加热融化培养基、倒平板。整个实验过程需要无菌操作,并且操作要求的注意事项比较多,需要各组学生互相配合,充分沟通,共同努力,才能顺利完成实验。绝大多数小组的学生观察到了细菌的单菌落,本实验获得了非常好的教学效果[5,6]。

[1] 洪庆华,徐正,秦璐璐.环境微生物学实验教学的改革[J].实验室研究与探索,2011,30(5):101-103.

[2] 邓百万,陈文强,彭浩.基于能力培养的微生物实验教学手段与方法的改革研究[J].实验技术与管理,2011,28(2):7-10.

[3] 周群英,王士芬.环境工程微生物学[M].第三版.北京:高等教育出版社,2008.

[4] 王云创,秦丹,刘俊杰.在实验教学中培养创造性思维能力[J].实验室研究与探索,2010,29(5):140-142.

[5] 梁璐怡,胡宝兰,朱亮.环境微生物学实验教学改革[J].实验技术与管理,2012,29(9):126-128,131.

[6] 罗志勇,张胜涛,周晓梅.高校学生创新实践能力培养的探索与思考[J].实验技术与管理,2009,26(7):28-30.

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