瑞舒伐他汀对内皮素1诱发肥大心肌细胞中[14C]苯丙氨酸结合的影响研究

王 新，锦见俊雄

他汀类药物是限制胆固醇生物合成的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶的特殊抑制剂。大量临床干预试验表明将他汀类药物作为一级和二级预防治疗后，可以极大地改善冠心病的治疗效果[1]。此外，研究还表明他汀类药物可以降低心力衰竭的发病率[2]。尽管他汀类药物对诱发的动脉粥样硬化的改善与降低血清中胆固醇水平有关，最近的研究表明其对血管壁有直接影响——抑制血管平滑肌细胞增殖并改变体外血管内皮细胞的动脉粥样化形成有关的基因表达[3]。但是，他汀类药物对肥大心肌细胞直接作用的机制尚不明确。本实验的目的是确定瑞舒伐他汀[4]是否对体外内皮素1诱发的肥大心肌细胞有直接抑制作用，并研究瑞舒伐他汀影响肥大心肌细胞的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 新生Wistar大鼠(1～2 d)从SLC(日本静冈县)采购。瑞舒伐他汀和普伐他汀分别由鲁南制药集团股份有限公司与三共理化学株式会社无偿提供。甲羟戊酸、角鲨烯、法尼基-焦磷酸(FPP)及牛儿-焦磷酸(GGPP)从美国Sigma公司采购。肉毒杆菌C3胞外酶和Y27632 〔(R)-(+)-反式-氮-(4-吡啶基)-4-(1-氨乙基)-环己甲酰胺·2盐酸〕从Calbiochem公司采购，[14C]苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)从Amersham生命科学公司采购。内皮素1从肽研究所(日本大阪)采购。甲羟戊酸、角鲨烯、FPP、GGPP、C3胞外酶、Y27632及内皮素1溶解在杜氏培养基(DMEM)中。

1.2 心肌细胞培养 新生大鼠心肌细胞在之前报道方法[5]的基础上加以改动[6]富集培养。分离心房、心室，将心室肌细胞分散在含有0.06%胶原酶Ⅱ(Worthington生物化学公司，纽约弗利霍德)的平衡盐溶液中，37 ℃下搅拌6 min，然后用移液管转移约20次。使用断续Percoll梯度法进行心肌细胞分化。使用纯化的心肌细胞进行实验，心肌细胞加入内皮素1(0、10-7mol/L)分别制备正常心肌细胞和肥大心肌细胞，培养24 h，取心肌细胞加入瑞舒伐他汀〔0(对照组)、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L〕和普伐他汀〔0(对照组)、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L〕培养24 h。

1.3 [14C]Phe结合率检测 不同浓度药物处理心肌细胞24 h后，向培养基中送气，并在-80 ℃下贮存。培养基(0.5 μl)使用醋酸酸化，并煮沸使内在蛋白酶失活并冻干。依照之前报道的方式[7]进行[14C]Phe结合率检测。

1.4 甲羟戊酸、角鲨烯、FPP、GGPP对心肌细胞[14C]Phe结合率的影响 心肌细胞接种在24孔板上，密度为6×104个/cm2。甲羟戊酸(10-6～10-4mol/L)、角鲨烯(10-6～10-4mol/L)、FPP(10-7～10-5mol/L)、GGPP(10-7～10-5mol/L)预培养6～12 h，再添加内皮素1(0、10-7mol/L)和瑞舒伐他汀(10-6mol/L)。然再添加0.2 μCi的[14C]Phe。培养细胞24 h后，检测[14C]Phe结合率。每种药物设6组，甲羟戊酸设对照组、空瑞舒伐他汀组、空甲羟戊酸组、10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组(见表1)，角鲨烯设对照组、空瑞舒伐他汀组、空角鲨烯组、10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组(见表2)，FPP设对照组、空瑞舒伐他汀组、空FPP组、10-7mol/L组、10-6mol/L组、10-5mol/L组(见表3)，GGPP设对照组、空瑞舒伐他汀组、空GGPP组、10-7mol/L组、10-6mol/L组、10-5mol/L组(见表4)。

1.5 C3胞外酶和Y27632对心肌细胞[14C]Phe结合率的影响 心肌细胞接种在24孔板上，密度为6×104个/cm2。C3胞外酶(0、2.5、12.5、25.0 μg/ml)和Y27632(0、10-7、10-6、10-5mol/L)预培养6～12 h，再添加内皮素1(10-7mol/L)。然后添加0.2 μCi的[14C]Phe。培养细胞24 h后，检测[14C]Phe结合率。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，计量资料多组比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 甲羟戊酸各组药物浓度(mol/L)Table 1 Drug concentration in mevalonate groups

表2 角鲨烯各组药物浓度(mol/L)Table 2 Drug concentration in squalene groups

表3 FPP各组药物浓度(mol/L)Table 3 Drug concentration in FPP groups

注：FPP=法尼基-焦磷酸

表4 GGPP各组药物浓度(mol/L)Table 4 Drug concentration in GGPP groups

注：GGPP=牛儿-焦磷酸

2 结果

2.1 不同浓度瑞舒伐他汀组正常心肌细胞和肥大心肌细胞[14C]Phe结合率比较 对照组与不同浓度瑞舒伐他汀组正常心肌细胞[14C]Phe结合率比较，差异有统计学意义(F=21.58，P<0.05)；其中10-6mol/L组正常心肌细胞 [14C]Phe结合率较其他4组下降，差异有统计学意义(P<0.05，见图1)。对照组与不同浓度瑞舒伐他汀组肥大心肌细胞[14C]Phe结合率比较，差异有统计学意义(F=21.12，P<0.05)；其中10-6mol/L组肥大心肌细胞[14C]Phe结合率较其他4组下降，差异有统计学意义(P<0.05，见图2)。

2.2 不同浓度普伐他汀组正常心肌细胞和肥大心肌细胞[14C]Phe结合率比较 对照组与不同浓度普伐他汀组正常心肌细胞[14C]Phe结合率比较，差异无统计学意义(F=19.24，P>0.05，见图3)。对照组与不同浓度普伐他汀组肥大心肌细胞[14C]Phe结合率比较，差异无统计学意义(F=18.65，P>0.05，见图4)。

2.3 不同浓度甲羟戊酸、角鲨烯、FPP、GGPP预处理后瑞舒伐他汀对心肌细胞[14C]Phe结合率的影响 对照组、空瑞舒伐他汀组、空甲羟戊酸组、10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组心肌细胞[14C]Phe结合率比较，差异有统计学意义(F=18.27,P=0.01)；其中对照组、空甲羟戊酸组、10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组心肌细胞[14C]Phe结合率较空瑞舒伐他汀组降低，10-4mol/L组心肌细胞[14C]Phe结合率较对照组、空甲羟戊酸组、10-6mol/L组、10-5mol/L组升高，差异均有统计学意义(P<0.05，见图5)。

对照组、空瑞舒伐他汀组、空角鲨烯组、10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组心肌细胞[14C]Phe结合率比较，差异有统计学意义(F=11.88,P=0.04)；其中对照组、空角鲨烯组、10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组心肌细胞[14C]Phe结合率较空瑞舒伐他汀组降低，差异均有统计学意义(P<0.05，见图6)。

对照组、空瑞舒伐他汀组、空FPP组、10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组心肌细胞[14C]Phe结合率比较，差异无统计学意义(F=10.07,P=0.14,见图7)。

对照组、空瑞舒伐他汀组、空GGPP组、10-6mol/L组、10-5mol/L组、10-4mol/L组肥大心肌细胞中[14C]Phe结合率比较，差异无统计学意义(F=10.42,P=0.11,见图8)。

2.4 不同浓度C3胞外酶和Y27632对肥大心肌细胞[14C]Phe结合率的影响 不同浓度C3胞外酶和Y27632组肥大心肌细胞中的[14C]Phe结合率比较，差异有统计学意义(F值分别为13.12和15.36，P值分别为0.03和0.02)；其中25.0 μg/ml C3胞外酶和10-5mol/L Y27632肥大心肌细胞 [14C]Phe结合率下降，差异有统计学意义(P<0.05，见图9A、B)。

3 讨论

本研究发现不同的他汀类药物产生的作用不同：瑞舒伐他汀显著抑制内皮素1诱发心肌细胞肥大，但是普伐他汀没有此作用。之前一项研究表明普伐他汀抑制肝细胞的甾醇合成，功效可能与其他亲脂性他汀类药物相同[8]。但是，在其他细胞中，如人体平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞及肌原细胞中，普伐他汀对胆固醇合成的抑制作用要比其他亲脂性他汀类药物低，瑞舒伐他汀的抗增殖作用也比其他普伐他汀强[9]。

注：与10-6mol/L组比较，*P<0.05

图1 不同浓度瑞舒伐他汀组正常心肌细胞[14C]Phe结合率比较

Figure1 Comparison of [14C]Phe combined rate of normal cardiac myocytes in different concentrations of rosuvastatin group

注：与10-6mol/L组比较，*P<0.05

图2 不同浓度瑞舒伐他汀组肥大心肌细胞中[14C]Phe结合率比较

Figure2 Comparison of [14C]Phe combined rate of hypertrophic cardiac myocytes in different concentrations of rosuvastatin group

图3 不同浓度普伐他汀组正常心肌细胞中[14C]Phe结合率比较

Figure3 Comparison of [14C]Phe combined rate of normal cardiac myocytes in different concentrations of pravastatin group

图4 不同浓度普伐他汀组肥大心肌细胞中[14C]Phe结合率比较

Figure4 Comparison of [14C]Phe combined rate of hypertrophic cardiac myocytes in different concentrations of pravastatin group

注：与空瑞舒伐他汀组比较，*P<0.05；与10-4mol/L组比较，△P<0.05

图5 不同浓度甲羟戊酸预处理后瑞舒伐他汀对心肌细胞[14C]Phe结合率的影响

Figure5 Effects of mevalonate different concentrations of [14C]Phe combined rate of cardiac myocytes

注：与空瑞舒伐他汀组比较，*P<0.05

图6 不同浓度角鲨烯预处理后瑞舒伐他汀对心肌细胞[14C]Phe结合率的影响

Figure6 Effects of squalene different concentrations of [14C]Phe combined rate of cardiac myocytes

注：1：对照组，2：空瑞舒伐他汀组，3：空FPP组，4：10-6mol/L组，5：10-5mol/L组，6：10-4mol/L组

图7 不同浓度FPP预处理后瑞舒伐他汀对心肌细胞[14C]Phe结合率的影响

Figure7 Effects of FPP different concentrations of [14C]Phe combined rate of cardiac myocytes

注：1：对照组，2：空瑞舒伐他汀组，3：空GGPP组，4：10-6mol/L组，5：10-5mol/L组，6：10-4mol/L组

图8 不同浓度GGPP预处理后瑞舒伐他汀对心肌细胞[14C]Phe结合率的影响

Figure8 Effects of GGPP different concentrations of [14C]Phe combined rate of cardiac myocytes

注：A为C3胞外酶，B为Y27632；A1:0 μg/ml组,A2:5.0 μg/ml组,A3:12.5 μg/ml组,A4:25.0 μg/ml组；B1：0 mol/L组,B2:10-7mol/L组，B3：10-6mol/L组,B4：10-5mol/L组；与25.0 μg/ml组比较，*P<0.05;与10-5mol/L组比较，△P<0.05

图9 不同浓度C3胞外酶组和Y27632组肥大心肌细胞[14C]Phe结合率比较

Figure9 Comparison of [14C]Phe combined rate of hypertrophic cardiac myocytes in different concentrations of C3 exoenzyme and Y-27631 group

甲羟戊酸新陈代谢产生一系列类异戊二烯化合物，其中包括角鲨烯、FPP、GGPP。角鲨烯是一种胆固醇先驱物，FPP、GGPP分别参与蛋白质的法尼基化和牛儿化[10]。甲羟戊酸路径在细胞生长和信号传导中有重要的作用[11]。本研究结果显示甲羟戊酸(10-4mol/L)降低瑞舒伐他汀对内皮素1诱发[14C]Phe结合增加的抑制作用。这表明，甲羟戊酸参与了瑞舒伐他汀对内皮素1诱发[14C]phe结合增加的抑制作用。甲羟戊酸还降低了瑞舒伐他汀对正常心肌细胞中[14C]Phe结合的抑制作用。此外，角鲨烯不影响瑞舒伐他汀对内皮素1诱发[14C]Phe结合增加的抑制作用，这表明瑞舒伐他汀的作用与其降脂性质无关。类似的，FPP、GGPP也不影响瑞舒伐他汀发挥作用。角鲨烯、FPP、GGPP自身不会影响基础或内皮素1诱发[14C]Phe结合。这些观察结果表明瑞舒伐他汀抑制内皮素1诱发[14C]Phe结合增加的作用与蛋白质牛儿化有关，但是与蛋白质法尼基变化无关。角鲨烯未能逆转瑞舒伐他汀诱发的对心肌细胞肥大的抑制作用，这表明非甾族新陈代谢产物而不是甾族代谢物有重要的作用。

本研究证明了亲水性瑞舒伐他汀具有直接抑制内皮素1诱导的心肌细胞肥大的作用。另外，发现甲羟戊酸可以降低瑞舒伐他汀的抑制作用，但是角鲨烯、FPP、GGPP没有此作用。此外，Rho是一种重要的牛儿蛋白质。为了确定Rho的抑制作用是否与瑞舒伐他汀对内皮素1诱发[14C]Phe结合增加的抑制作用有关，本研究采用C3胞外酶培养细胞，ADP核糖基化并失活Rho。此外，还评估了Y27632(一种特殊的Rho相关激酶抑制剂)的作用。C3胞外酶(一种Rho抑制剂)及Y27632对内皮素1诱发的心肌细胞肥大有类似的抑制作用。瑞舒伐他汀减少内皮素1诱发的Rho A蛋白表达的增加，且甲羟戊酸可以降低此影响。这些结果表明瑞舒伐他汀部分通过Rho蛋白/Rho激酶路径来抑制内皮素1诱发的心肌细胞肥大。

Rho蛋白是独特的小GTP绑定蛋白，可以被C3胞外酶抑制[12-13]。在本研究中，C3胞外酶和Rho激酶抑制剂Y27632对内皮素1诱发心肌细胞肥大有类似的抑制作用。这些结果表明Rho/ROCK路径在肥大中发挥重要作用，在心肌细胞的活性生长中有重要作用。尽管本研究没有证明Rho的抑制与瑞舒伐他汀抑制心肌肥大之间有直接的关系，但是本研究结果表明心肌细胞肥大受瑞舒伐他汀抑制，且部分是通过抑制Rho信号路径实现的。总之，本研究证明了瑞舒伐他汀部分通过抑制Rho活性，抑制内皮素1诱发的心肌细胞肥大。

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