液相色谱—串联质谱法测定猪配合饲料中吉他霉素

杨琳芬 饶辉 符金华 赵薇娜

（农业部饲料质量监督检验测试中心（南昌），江西 南昌 330029）

液相色谱—串联质谱法测定猪配合饲料中吉他霉素

杨琳芬 饶辉 符金华 赵薇娜

（农业部饲料质量监督检验测试中心（南昌），江西 南昌 330029）

采用液相色谱－串联质谱仪测定猪配合饲料中吉他霉素。试样中的吉他霉素经20/80（V/V）甲醇/水提取，取部分上清液稀释，用美国waters公司生产的固相萃取柱（6cc/200mgOasisHLB）净化，氮气吹干，初始流动相复溶，上液相色谱－串联质谱仪测定，保留时间和离子丰度比定性，外标法定量。本方法中吉他霉素检测限为0.01mg/kg、定量限为0.05mg/ kg。吉他霉素的线性范围为5～200ng/mL，相关系数r大于0.999。在0.05～50mg/kg的添加水平上，吉他霉素的平均回收率为63.3%～106.6%，相对标准偏差为1.6%～10.3%。

液相色谱—串联质谱法；猪配合饲料；吉他霉素

吉他霉素对革兰氏阳性菌和某些阴性菌、支原体、立克氏体、螺旋体等有效，主要用于抗青霉素的葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌感染。吉他霉素是猪配合饲料中常用的饲料药物添加剂，防治慢性呼吸系统疾病，促进生猪的生长，提高生猪养殖效益。2001年农业部第168号公告《饲料药物添加剂使用规范》规定，猪配合饲料中吉他霉素添加量：用于促进生长，5～55mg/kg；用于防治疾病，80～330mg/kg，连用5～7d，休药期7d。为了防止饲料生产企业和生猪养殖户在猪配合饲料中超量添加，违法使用，开展猪配合饲料中吉他霉素的测定意义重大。

1 原理

饲料中的吉他霉素经甲醇水提取，OasisHLB纯化，初始流动相复溶，过0.45μm滤膜，上液质测定，外标法确证及筛查。

2 样品制备

按照GB/T20195制备试样，磨碎，全部通过0.28 mm孔筛，混匀，装入密闭容器中。

3 仪器设备

AB104-N电子天平、Agilent6410BQQQ液质联用仪、HITACHICRG离心机。

4 操作步骤

4.1 试样提取

精确称取试样2g于250mL锥形瓶中，准确加入20mL提取液（甲醇+水=20+80），振荡30min，转入离心管中，10000r/min离心5min，上清液备用。

4.2 样品纯化

固相萃取柱（6cc/200mgOasisHLB）分别用3 mL甲醇和3mL水活化，准确移取5mL上清液过柱，清洗1：3mL5%甲醇及2%乙酸；清洗2：3mL5%甲醇及2%氨水；清洗3：3mL65%甲醇及2%氨水，近干后用甲醇洗脱，收集洗脱液。在氮吹装置上50℃下用氮气吹干，准确加入1mL初始流动相（乙腈+0.1%甲酸水=90+10）复溶，过0.45μm微孔滤膜，上LC-MS/MS测定。上机液中的药物浓度应稀释在线性范围内。

4.3 测定

4.3.1 液相色谱条件。色谱柱：AgilentZORBAXSBC182.1×100mm，1.8μm；柱温：30℃；流动相：A：0.1%甲酸水溶液；B：0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱条件见表1。

4.3.2 质谱条件。离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM。使用前，应调节各气体流量，以使质谱灵敏度达到检测要求。质谱参数应优化至最佳。定性离子对、定量离子对及碰

撞能量的参考值见表2。

表1 流动相梯度洗脱条件min，%

表2 定性、定量离子对及碰撞能量的参考值m/z，V

4.3.3 定性测定。在相同试验条件下，样品中待测物的

保留时间与标准工作液的保留时间偏差在±2.5%之内，并且样品图谱中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近标准工作液中对应的定性离子对的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

4.3.4 定量测定。按照上述液相色谱－串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，以色谱峰面积进行单点或多点校正定量，样品溶液中待测物的响应值应在仪器规定的线性范围内。上述色谱和质谱条件下，对照品的工作曲线图、对照品的色谱质谱图和样品的色谱质谱图见图1～3。

图1 吉他霉素液质对照品的工作曲线图

图2 吉他霉素对照品的色谱质谱图

图3 吉他霉素样品的色谱质谱图

5 结果计算

试样中某种待测物的含量X以质量分数（mg/ kg）表示，按式（1）计算。

式中：

m1—计算机外标法自动计算所得到的某待测物的质量，单位为微克（μg）；

m—试样质量，单位为克（g）；

n—稀释倍数。

测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

6 重复性

同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差不大于20%。

7 结果分析

采用液质联用仪筛查确证猪配合饲料中吉他霉素等常用的饲料药物添加剂，结果发现乳猪奶粉、乳猪人工乳、乳猪料、仔猪料和小猪料、中猪料、大猪料和生长育肥猪后期料均含有吉他霉素。样品纯化应采用美国waters公司生产的固相萃取柱（6cc/200mg OasisHLB），按优化的OasisHLB程序进行纯化，这样提取的上机液纯度高，基质干扰少。

1004-2342（2014）05-0013-02

S816.17

B

2014-07-31）