基质金属蛋白酶9基因-1562C/T多态性与广东汉族人群社区获得性肺炎的关联研究

张永标，刘小云，符永玫，毕筱刚，张扣兴

基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)为MMPs家族中的成员之一，可以降解明胶、弹性蛋白、Ⅳ型和Ⅴ型胶原，在血管形成、组织再生、动脉粥样病变、细胞迁移、肿瘤转移等病理和生理过程中发挥着重要作用[1]。有研究表明，MMP-9基因启动子-1562C/T位点的多态性与一些呼吸系统疾病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺结核有关[2-3]，而目前国内外关于MMP-9及其基因-1562C/T多态性与社区获得性肺炎(community acquired pnenmonia，CAP)的关系则少有报道。本研究对广东汉族人群社区CAP患者血清MMP-9的水平、MMP-9基因-1562C/T的基因型与等位基因进行了检测，并以健康广东汉族人群为对照，旨在揭示MMP-9是否参与了CAP的病理过程，以及MMP-9基因-1562C/T多态性对广东汉族人群CAP的遗传易患性及对MMP-9的表达水平是否存在影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 病例组 纳入2012年5—12月中山大学附属第三医院门急诊和住院诊治的广东汉族CAP患者100例为病例组，其中男44例，女56例；年龄23～61岁，平均(37.4±2.1)岁。患者符合2006年中华医学会呼吸病学分会制定的《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》的临床诊断标准[4]：(1)新近出现的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病症状加重，并出现脓性痰，伴或不伴胸痛；(2)发热；(3)肺实变体征和/或闻及湿性啰音；(4)白细胞计数>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴细胞核左移；(5)胸部X线检查显示片状、斑片状浸润性阴影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液。以上(1)～(4)项中任何一项加第(5)项，并排除肺结核、肺部肿瘤、非感染性肺间质性疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、肺嗜酸粒细胞浸润症及肺血管炎后，即可明确临床诊断。排除标准为：(1)其他肺部基础疾病如COPD、哮喘、支气管扩张症、肺结核等；(2)心脑血管疾病如高血压、冠心病、心力衰竭、脑卒中及其后遗症等；(3)自身免疫性疾病如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化等；(4)代谢性疾病如糖尿病等；(5)应用激素或免疫抑制剂；(6)各种肿瘤性疾病；(7)慢性肝炎、肝硬化；(8)慢性肾功能不全。患者均有发热症状(最高腋下体温≥37.3 ℃)。

1.1.2 对照组 以同期本院门诊体检的健康广东汉族体检者96例为对照组，其中男42例，女54例；年龄20～60岁，平均(38.1±1.5)岁。广东汉族人群指3代以上均为汉族血缘且籍贯为广东省，受试者之间均无血缘关系。本研究获得中山大学附属第三医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。病例组与对照组的性别构成、年龄比较，差异无统计学意义(χ2= 0.001，P=0.972；t=0.675，P=0.512)。

1.2 标本收集与保存 采集病例组发病期(处于发热期间)和对照组空腹外周静脉血6 ml分别置于干燥管和乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管。病例组治疗后(最高腋下体温≤37.2 ℃后1周)再采集空腹外周静脉血3 ml置于干燥管。干燥管室温静置30 min后，2 000 r/min离心15 min，离心半径为10 cm,取上清至已消毒EP管中，待测MMP-9；EDTA抗凝管中全血采用血液基因组提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit，北京天根科技有限公司)提取全血DNA作为PCR模板，具体操作严格按试剂盒说明书进行。将分离后的血清和提取所得的基因组DNA均置于-80 ℃冰箱冻存备用，全部标本收集完毕后统一检测。

1.3 血清MMP-9水平测定 应用人MMP-9 ELISA 试剂盒(KE1175 Human MMP-9 ELISA Kit，美国Immunoway公司)，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测血清中MMP-9水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 MMP-9基因-1562C/T多态性分析 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分析病例组与对照组MMP-9基因-1562C/T位点的多态性。应用Primer 5.0软件设计引物，上游引物序列为5′-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3′，下游引物序列为5′-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3′，并委托美国Invitrogen公司合成，产物长度436 bp。PCR反应体系为模板DNA 20～100 ng，10×PCR Buffer 2.5 μl，MgCl21.5 mmol，Premix Ex TaqTM酶(日本TAKARA公司)0.75 U，dNTPs 200 μmol，200 nmol/L上、下游引物各1.0 μl，用ddH2O补足至终体积20.0 μl。PCR反应条件为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s(35次循环)，最后72 ℃延伸10 min。对PCR产物采用限制性内切酶Sph I(日本TAKARA公司)进行酶切，酶切体系为PCR产物10.0 μl，10×H Buffer 2.0 μl，Sph I内切酶1.0 μl，ddH2O 7.0 μl，终体积20.0 μl，37 ℃水浴过夜消化。酶切后产物分析采用2%琼脂糖凝胶电泳法，电泳后仅有436 bp一条条带为CC基因型，有242 bp、194 bp两条条带为TT基因型，有436 bp、242 bp、194 bp三条条带为CT基因型。

1.5 MMP-9基因-1562C/T PCR产物测序分析 随机抽取酶切后产物电泳结果显示为CC、CT、TT基因型的酶切前PCR产物各5份，送美国Invitrogen公司进行测序，以验证酶切后产物电泳结果。测序获得的核苷酸序列在-1562位碱基处仅有C单峰为CC基因型，仅有T单峰为TT基因型，有CT双峰为CT基因型。

2 结果

2.1 病例组与对照组血清MMP-9水平比较 病例组发病期、治疗后和对照组的血清MMP-9水平分别为(342.85±107.63)、(203.57±80.61)、(184.74±93.46)μg/L。病例组发病期MMP-9水平高于治疗后和对照组，差异有统计学意义(t配对=4.512，t=5.305，P<0.05)；病例组治疗后MMP-9水平与对照组比较，差异无统计学意义(t=2.429，P=0.143)。

2.2 PCR产物测序与酶切后电泳结果 酶切后产物2%琼脂糖凝胶电泳结果显示，病例组CC基因型73例、CT基因型27例；对照组CC基因型71例、CT基因型25例；两组均未检测到TT基因型。部分酶切后产物电泳图谱见图1。随机抽取的酶切前PCR产物测序结果与酶切后产物电泳结果所示基因型完全一致。

注：M为DNA Marker DL2000，1、2、3、5、6、8泳道为CC基因型，4、7泳道为CT基因型

图1 PCR产物酶切后凝胶电泳图

Figure1 Electrophoregram of enzymolysis PCR produce

2.3 Hardy-Weinberg平衡分析结果 病例组与对照组基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律(P>0.05，见表1)。

表1 病例组与对照组-1562C/T基因型的Hardy-Weinberg平衡分析 (例)

Table1 Hardy-Weinberg balance analysis of genotypes of the MMP-9 gene -1562C/T between the case group and the control group

2.4 -1562C/T基因型及等位基因频率分布 两组CC基因型、CT基因型的频率分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)；C等位基因和T等位基因的频率分布比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

表2 病例组与对照组-1562C/T基因型频率及等位基因频率分布比较〔n(%)〕

Table2 Comparison of genotypes and alleles distribution of the MMP-9 gene -1562C/T between the case group and the control group

组别例数 基因型CC CT TT等位基因C T对照组9671(74 0)25(26 0)0167(87 0)25(13 0)病例组10073(73 0)27(27 0)0173(86 5)27(13 5)χ2值0 0230 020P值0 8790 889

2.5 -1562C/T基因型对血清MMP-9水平的影响 病例组CC基因型与CT基因型患者发病期血清MMP-9水平，对照组CC基因型与CT基因型者血清MMP-9水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表3)。

Table3 Comparison of the serum MMP-9 level between different genotypes of the MMP-9 gene -1562C/T between the case group and the control group

组别例数MMP-9CC CTt值P值对照组96175 23±89 46169 36±93 340 9760 160病例组100314 13±125 13320 29±118 121 2900 100

注：MMP-9=基质金属蛋白酶9

3 讨论

MMP-9基因定位于人类染色体20q11.1-13.1上，其转录和表达受上游启动子的调控，多种炎性细胞因子和生长因子通过与启动子上的转录因子结合位点或抑制元件结合后，可启动或关闭MMP-9基因的表达[1]。因此，MMP-9基因启动子上一些位点的单核苷酸多态性和机体内MMP-9的水平与某些疾病的发生、发展存在着密切关系。

有研究表明MMP-9参与了肝纤维化、急性冠脉综合征、急性脑梗死等疾病的发病过程[5-7]。本研究结果显示，CAP患者发病期血清MMP-9水平较对照组明显升高，而在治疗后又明显下降，且降至与对照组无统计学差异的水平，提示MMP-9参与了CAP的炎性反应过程。此外有研究结果认为，循环中MMP-9的水平以及MMP-9与基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的比值(MMP-9/TIMP-1)尚可作为判断CAP病情严重性的指标[8]。国外有研究发现，在肺炎支原体引起的成人CAP患者中，外周血单个核细胞(PBMCs)MMP-9的表达和血清MMP-9的水平在急性期显著高于恢复期，且血清MMP-9的水平与外周血白细胞有关，说明CAP时MMP-9水平升高的主要原因之一是由于白细胞高水平表达MMP-9[9]。MMP-9可降解胞外基质中的Ⅳ型胶原，有利于促进中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞向炎症部位迁移。至于MMP-9在CAP中的诱导产生和作用机制等尚待于进一步研究。

本研究中病例组与对照组MMP-9基因启动子-1562C/T位点的CC、CT、TT基因型及C、T等位基因分布无统计学差异，不同基因型的患者之间和对照组血清MMP-9的水平亦均无统计学差异。以上结果揭示了广东汉族人群MMP-9基因-1562C/T多态性与CAP的遗传易患性无关，且不影响MMP-9的表达水平。本研究结果与Chiang等[10]报道的MMP-9基因多态性与CAP关系的研究结果相同。有关-1562C/T多态性对MMP-9表达水平影响的研究结果并不一致。国外Demacq等[ 11 ]研究发现，巴西健康白人MMP-9基因-1562C/T多态性对MMP-9的表达水平无明显影响。Ghaderian等[12]报道急性心肌梗死患者-1562C/T位点TT和CT基因型的血清MMP-9水平明显高于CC基因型。MMP-9表达调节的机制目前尚不明确，因而无法对这些研究结果给予合理解释。本研究中CAP患者的血清MMP-9水平明显升高，-1562C/T多态性不影响CAP患者和对照组MMP-9的表达水平，提示CAP时MMP-9的转录和表达可能受到MMP-9基因启动子上其他多态性位点的调控，或存在其他影响MMP-9分泌、活化的调节机制。

综上所述，MMP-9参与了CAP的炎性反应过程，MMP-9基因-1562C/T多态性与广东汉族人群CAP的易患性无关，且不影响MMP-9的表达水平。本研究对象为广东汉族人群，Chiang等[10]的研究对象为未分种族的台湾地区人群。本研究中病例组与对照组的基因型分布经Hardy-Weinberg平衡分析表明样本具有群体代表性，由于不同区域和种族的人群中MMP-9基因的多态性可能不完全相同，因此本研究的局限性在于其结果仅可反映广东汉族人群，尚不代表中国其他种族人群或其他区域汉族人群。对于广东汉族人群MMP-9基因启动子中非-1562C/T位点、中国其他种族人群或其他区域汉族人群MMP-9基因启动子中包括-1562C/T位点的多态性与CAP遗传易患性的关系及其对MMP-9表达水平的影响等均值得更进一步研究。

1 Vandooren J,Van den Steen PE,Opdenakker G.Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9(MMP-9):the next decade[J].Crit Rev Biochem Mol Biol,2013,48(3):222-272.

2 Chen L,Wang T,Liu L,et al.Matrix metalloproteinase-9-1562C/T promoter polymorphism confers risk for COPD:a meta-analysis[J].PLoS One,2013,8(3):e60523.

3 Lee SH,Han SK,Shim YS,et al.Effect of matrix metalloproteinase-9-1562C/T gene polymorphism on manifestations of pulmonary tuberculosis[J].Tuberculosis(Edinb),2009,89(1):68-70.

4 中华医学会呼吸病学分会.社区获得性肺炎诊断和治疗指南[J].中华结核和呼吸杂志,2006,29(10):651-655.

5 李德辉.基质金属蛋白酶9对慢性乙型肝炎及肝硬化患者肝纤维化程度的评估[J].中国全科医学,2011,14(9):945-947.

6 段景琪,吕肖锋.血清基质金属蛋白酶-9与2型糖尿病并发急性冠脉综合征的关系[J].中国全科医学,2009,12(22):2018-2020,2024.

7 俞鸣.急性脑梗死患者血清血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶-9水平的动态变化及其意义[J].中国全科医学,2010,13(18):1983-1985.

8 Chiang TY,Yu YL,Lin CW,et al.The circulating level of MMP-9 and its ratio to TIMP-1 as a predictor of severity in patients with community-acquired pneumonia[J].Clin Chim Acta,2013,424:261-266.

9 Puljiz I,Markotic A,Cvetko Krajinovic L,et al.Mycoplasma pneumoniae in adult community- acquired pneumonia increases matrix metalloproteinase-9 serum level and induces its gene expression in peripheral blood mononuclear cells[J].Med Sci Monit,2012,18(8):CR500-CR505.

10 Chiang TY,Shyu LY,Tsao TC,et al.Elevated plasma matrix metalloproteinase-9 protein and its gene polymorphism in patients with community-acquired pneumonia[J].Clin Chem Lab Med,2011,50(3):449-454.

11 Demacq C,Vasconcellos VB,Marcaccini AM,et al.Functional polymorphisms in the promoter of the matrix metalloproteinase-9(MMP-9)gene are not linked with significant plasma MMP-9 variations in healthy subjects[J].Clin Chem Lab Med,2008,46(1):57-63.

12 Ghaderian SM,Akbarzadeh Najar R,Tabatabaei Panah AS.Genetic polymorphisms and plasma levels of matrix metalloproteinases and their relationships with developing acute myocardial infarction[J].Coron Artery Dis,2010,21(6):330-335.